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免疫熒光技術(shù)有兩種檢測方法：用熒光標(biāo)記抗體示蹤或檢測相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法,；用已知的熒光標(biāo)記抗原示蹤或檢測相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。（熒光抗體方法較常用）

1.在開始實(shí)驗(yàn)研究前，有哪些因素需要考慮,？

（1）根據(jù)抗原選擇合適的抗體,，確認(rèn)抗原可以識別哪一種異構(gòu)體以及抗原表位的位置,。

（2）確認(rèn)目的蛋白在該樣本中是否表達(dá)。

（3）根據(jù)所要研究的目標(biāo)蛋白來確定合適的樣本類型（石蠟切片,、冰凍切片還是細(xì)胞制備物等）,。

（4）選擇抗體時需要考慮該抗體的物種交叉反應(yīng)。

（5）關(guān)于蛋白,，需要考慮它的組織定位和細(xì)胞定位,，以及染色時是否應(yīng)該有信號。

（6）選擇合適的固定方法及抗原修復(fù)方法,。

（7）抗體的工作濃度或稀釋比例,，以及抗體的物種來源也是需要考慮的重要因素。

2.免疫組化實(shí)驗(yàn)里為什么要對樣品進(jìn)行處理,？

    樣品處理是為了調(diào)控樣本中蛋白的表達(dá)水平,，如果是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，就需要使用適當(dāng)?shù)囊种苿┗蚣せ顒﹣砩险{(diào)或下調(diào)細(xì)胞中某種蛋白質(zhì)的表達(dá),；如果是體內(nèi)實(shí)驗(yàn),，就需要考慮更多的因素，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)對象是活的實(shí)驗(yàn)動物,，在選擇抑制劑或激活劑,、激動劑或拮抗劑時，應(yīng)盡量避免由于非特異性結(jié)合其它蛋白所導(dǎo)致的非特異性效應(yīng),。對于某些特殊試驗(yàn)樣品,，比如腦，我們需要確保細(xì)胞的滲透性,，讓化合物能真正進(jìn)入細(xì)胞或血腦屏障,。另外需要確保所使用的化學(xué)品能夠溶于合適的溶劑，還有確定適合的給藥途徑（注射或口服）,。

3.請問如何根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)對象來選擇不同的樣本形式呢,？

    對于細(xì)胞制備物，它們常見的形式是涂片或培養(yǎng)的細(xì)胞系,。對于組織樣本,，常用的是石蠟包埋的組織切片，福爾馬林固定,。是因?yàn)樗鼈兡軌虮３纸M織形態(tài)與蛋白抗原性之間的zuijia平衡,。石蠟包埋的組織切片很穩(wěn)定，并且易于使用,。但它的不足之處是很耗時（需要對切片進(jìn)行脫蠟處理和抗原修復(fù)）,。一般來說，石蠟切片適用于4微米厚的切片,。如果切片厚度大于4微米,，抗體可能會被困住,，導(dǎo)致假陽性染色，這是我們需要避免的,。

    另一種常見的樣本形式是冰凍組織切片,，這對于不能經(jīng)受醛固定處理和石蠟處理的抗原來說非常理想，因此這些抗原將呈現(xiàn)出更天然的狀態(tài),，但冰凍切片的缺點(diǎn)是組織形態(tài)可能不佳,。冷凍切片通常僅適用于厚度為4-10微米的薄切片，超過這個厚度的切片可能會困住抗原,，導(dǎo)致假陽性染色結(jié)果,。如果要研究的組織類型無法做成這種厚度的薄切片，可以考慮采用漂片,。該技術(shù)一般用于腦組織和脊髓,，在發(fā)育研究中，這是一項(xiàng)非常有用的技術(shù),，可用于厚度達(dá) 40 微米的更大切片,。缺點(diǎn)是操作起來更加不便，整個過程中組織樣品都處于自由漂浮狀態(tài),，之后還必須將它們固定在載玻片上進(jìn)行觀察，操作有一定的難度,；另一個缺點(diǎn)就是非常耗時,。