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ELISA實(shí)驗(yàn)之細(xì)胞樣本的處理方法
閱讀：2061 發(fā)布時(shí)間：2021-3-17
細(xì)胞樣本根據(jù)目的物所在部位可選擇細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培養(yǎng)上清作為樣本,。 需要注意的是： 因該類樣本干擾因素較多,， 如細(xì)胞狀態(tài)、 細(xì)胞數(shù)量(大于 10^6),、ph(約為 7),、培養(yǎng)基鹽離子濃度、采樣時(shí)間等,，所以可能存在檢測(cè)不出的情況,。
如果目的物是分泌型，主要在胞外，即可選擇細(xì)胞培養(yǎng)上清作為樣本,，如果目的物主要存在于胞內(nèi),，則建議選擇細(xì)胞裂解液作為樣本類型。細(xì)胞培養(yǎng)上清處理方法相對(duì)簡(jiǎn)單,，取細(xì)胞培養(yǎng)上清,，1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測(cè),。
細(xì)胞裂解液：
1）貼壁細(xì)胞需要先用胰酶消化,，離心收集細(xì)胞（懸浮細(xì)胞可直接離心收集） ；
2）將收集到的細(xì)胞用冷PBS 洗3次,；
3）物理方法裂解細(xì)胞（可先超聲破碎細(xì)胞,，再反復(fù)凍融） ：
⇒ 超聲破碎：取適量PBS 重懸細(xì)胞,，用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液,，使細(xì)胞急劇震蕩破裂,；
⇒ 反復(fù)凍融：將待破碎的細(xì)胞在-20 度以下冰凍，室溫融解,，反復(fù)3次,，使細(xì)胞溶脹破碎；
4）將標(biāo)本于2-8 度 1500×g 離心 10 分鐘,，收集上清備用,。
一般情況下，物理方法如反復(fù)凍融,，勻漿等方法會(huì)比化學(xué)方法好,，因?yàn)榛瘜W(xué)方法會(huì)引入酸或堿，可能會(huì)對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響,。我們也做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)測(cè)化學(xué)提取液和洗滌劑對(duì)ELISA檢測(cè)的影響,，如 RIPA、TritonX-100,、NP-40和SDS,、脫氧膽酸鈉、β巰基乙醇,、DTT 和尿素,。根據(jù)我們的質(zhì)檢結(jié)果,，高濃度的洗滌劑會(huì)影響ELISA檢測(cè)的終結(jié)果,。然而，其效果會(huì)洗滌劑濃度的降低而減少,。與其他化學(xué)裂解緩沖液相比,，1％的 Triton X-100 和 1％NP-40 對(duì) ELISA檢測(cè)的影響較小。如果一定要用化學(xué)提取方法的話，推薦用這兩種洗滌劑來(lái)提取靶蛋白,。利用化學(xué)的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,，如果去污劑成分會(huì)干擾抗原抗體反應(yīng)影響檢測(cè)效果，推薦利用透析和超濾的方法除去去污劑成分,。
處理樣本的過(guò)程就是收集目標(biāo)蛋白的過(guò)程,，由于蛋白容易變性，降解,，故該過(guò)程應(yīng)盡量溫和,。樣本處理之后的儲(chǔ)存也非常重要，尤其注意不要反復(fù)凍融,，樣本處理之后可分裝密封保存,， 4 度保存應(yīng)小于 1 周，-20 度不應(yīng)超過(guò) 1 個(gè)月,，-80度不應(yīng)超過(guò)2個(gè)月,。在標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解,。樣本的處理是實(shí)驗(yàn)成功的第yi步, ,，以上就是關(guān)于常見(jiàn)樣本處理方法的一個(gè)簡(jiǎn)述，供研究者參考,。