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ELISA實驗常見問題解析
閱讀：1895 發(fā)布時間：2021-3-5ELISA實驗因靈敏度高,，特異性強在生物科研上得到了廣泛的認可,，但對初學者而言，如不注意實驗操作過程中的各個環(huán)節(jié),，可能會對終的實驗結果產生比較大的影響,，比如實驗出現白板,，顯色弱靈敏度低，花板無梯度背景高等現象,。下面對以上實驗現象進行一一解析,。
1.白板現象
在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中所有孔的顏色均為無色,，即無信號呈現,。
出現該現象的可能原因：
試劑已過保質期，不同批次稀釋液交叉使用,。
錯加漏加檢測A,，檢測B或者底物溶液TMB。
洗板或者加樣過程中,，酶標記物被污染失活,，稀釋液中含有酶抑制劑如疊氮吶等。
配置稀釋液的蒸餾水可能被污染,。
洗滌液是濃縮型的,，沒有按比例進行稀釋。
酶標記物的活性和效價比較低,。
溶液的PH值不正確,，一般稀釋液的PH值應保持在7.2-7.4。
2.顯色弱靈敏度低
在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后,，酶標板中孔的顯色比較淺,，即只有微弱的信號呈現,。
出現該現象的可能原因：
產品過有效期,，試劑沒有按規(guī)定進行適當的保存。
試劑,，標準品或者樣品在使用前沒有平衡到室溫,。
少加了試劑的量或者加入試劑的稀釋比例不當。
洗板或者加樣過程中,，酶標物受污染失活,。
孵育時間和孵育溫度未達到實驗要求。
洗滌液稀釋倍數不符合要求,，洗板次數過多,，洗板沖擊力過大，洗板浸泡時間過長,。
底物溶液TMB顯色時間太短,。
3.花板無梯度背景高
在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中的孔有顏色但沒有梯度,，背景也可能較高,，,。
出現該現象的可能原因：
底物溶液TMB未置于陰涼避光處保存，實驗前溶液已經變藍,。
孵育溫度過高或者孵育時間過長,，發(fā)生了較強的非特異性吸附。
沒有按說明書要求洗板,，特別是洗板時洗滌液的量少加了,。
加樣時沒有換槍頭造成交叉污染。
花板現象：低濃度或者低活性的包被抗體或者檢測抗體,，封閉不足導致的本底不穩(wěn)定,，洗板不充分，包被板子的問題,。
綜上所述：在ELISA實驗中應注意以下問題：
1.在實驗前應該按相關要求將實驗試劑平衡至室溫,。
2.包被抗體和檢測抗體應該是有高活性的且都針對同一抗原。
3.試劑保存：蛋白抗體類試劑保存于-20攝氏度,，顯色液洗滌液保存于2-8攝氏度,。
4.各試劑在使用前應充分混勻，以保證試劑的均一性和準確性,。
5.嚴格控制反應溫度和反應試劑,。
6.洗板次數，洗板液的量,，洗板液浸泡時間的長短,，洗板的力度都是應該注意的問題。
7.相關濃縮液應按要求稀釋到相應比例方可使用,，PH值要保持在7.2-7.4之間,。
8.在終止反應時盡量避免微孔中存有氣泡。
9.終止反應完成后應該在2min內完成酶標儀讀數,。