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    因為神經(jīng)干細胞(Neural Stem Cell)具有自我更新和多向分化的潛能,，因而，可以選用懸浮神經(jīng)球培養(yǎng)的方法來獲得和研討。即將胚胎腦組織處理成單個細胞后,，只有具有自我更新才能的細胞才能在培養(yǎng)液中克隆增殖成為懸浮的神經(jīng)球，并隨著傳代的進行,，堅持增殖才能和向多種神經(jīng)子代細胞分化的才能,。

    一、神經(jīng)干細胞的分別和傳代

    無菌條件下取重生SD大鼠(出世48h內(nèi))腦組織,，D-Hanks液充分漂洗后,，在解剖顯微鏡下剝離腦膜，準確分別海馬,，用眼科剪將海馬剪碎后,，再轉(zhuǎn)移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的無血清培養(yǎng)基，吸管吹打機械分別單細胞懸液,，臺盼藍染色后細胞計數(shù),，調(diào)整細胞濃度為5×104~5個/ml，置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),，每孔參加細胞懸液500μl,。待神經(jīng)球構(gòu)成后再次機械分別克隆單細胞懸液，仍以5×104個/ml的細胞濃度置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),，每孔參加細胞懸液500μl,。爾后每7d機械分別克隆傳代1次，方法同前,。
 
    二,、BrdU符號

    將BrdU溶于無血清培養(yǎng)基，過濾除菌后參加神經(jīng)球構(gòu)成后再次機械分別克隆的單細胞懸液中(BrdU終濃度為5μmol/L),，培養(yǎng)7d待新的神經(jīng)球構(gòu)成后,，將神經(jīng)球轉(zhuǎn)移到預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中，貼壁2h行BrdU免疫細胞化學(xué)染色,。
 
    三,、神經(jīng)干細胞的誘導(dǎo)分化

    選取部分上述傳代后構(gòu)成的次代神經(jīng)球栽培于預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中，并參加有血清培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DMEM/F12),，一部分神經(jīng)球于貼壁2h后行Nestin免疫細胞化學(xué)染色,，另一部分神經(jīng)球持續(xù)培養(yǎng)，調(diào)查其生長分化情況。另將一部分次代神經(jīng)球機械分別制成單細胞懸液后參加有血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng),，7d后分別行Tuj1 ,、GFAP 、Galc 免疫細胞化學(xué)染色,。
 
    四,、條件培養(yǎng)液的制備

    取1g雞胚的后肢骨骼肌組織，參加9mlD-Hanks液中冰浴勻漿15min,，離心獲得上清液,，過濾除菌后，加兩倍體積DMEM/F12培養(yǎng)基制成條件培養(yǎng)液備用,。
 
    五,、神經(jīng)干細胞的定向誘導(dǎo)分化

    將一部分次代神經(jīng)球機械分別制成單細胞懸液后分別參加條件培養(yǎng)液和有血清培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)中對照貼壁培養(yǎng)，7d后均行ChAT免疫細胞化學(xué)染色,。