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蛋白濃度測定的方法具體有哪些?
閱讀：9978 發(fā)布時間：2019-10-23蛋白質(zhì)濃度測定是利用化學或物理方法測定蛋白質(zhì)濃度,，一般蛋白濃度測定的方法有很多種，每種方法都有優(yōu)點和局限性,，下面我們就具體看一下蛋白濃度測定的方法都有哪些,。
蛋白濃度測定的方法：
1.紫外分光光度法
紫外光譜吸收法測定蛋白質(zhì)含量是講蛋白質(zhì)溶液直接在紫外分光光度計中測定的方法，不需要任何試劑,，操作簡單且易回收,。蛋白質(zhì)溶液在280nm附近有強烈的吸收，這是由于蛋白質(zhì)中酪氨酸,、色氨酸殘基而引起的,，所以光密度受這兩種氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取過程中雜有的核酸對測定結(jié)果引起極大誤差，其大吸收在260nm,。所以同時測定280及260nm兩種波長的吸光度,，通過計算可得較為正確的蛋白質(zhì)含量。
2.雙縮脲法
利用半飽和硫酸銨或27.8％硫酸鈉——亞硫酸鈉可使血清球蛋白沉淀下來,，而此時血清白蛋白仍處于溶解狀態(tài),，因此可把兩者分開，這種利用不同濃度的中性鹽分離蛋白的方法稱為鹽方法,。鹽析分離蛋白質(zhì)的方法不僅用于臨床醫(yī)學,，而且還廣泛地用于生物化學研究工作中，如一些特殊蛋白質(zhì)—酶,、蛋白激素等的分離和純化,。
蛋白質(zhì)和雙縮脲一樣，在堿性溶液中能與銅離子形成紫色絡(luò)合物（雙縮脲反應(yīng)）,，且其呈色深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比,，因此可于蛋白質(zhì)的定量測定。
但必須注意,，此反應(yīng)并非蛋白質(zhì)所*,，凡分子內(nèi)有兩個或兩個以上的肽鍵的化合物以及分子內(nèi)有—CH2—NH2等結(jié)構(gòu)化合物，雙縮脲反應(yīng)也呈陽性,。本實驗用27.8％硫酸鈉—亞硫酸鈉溶液稀釋血清,，取出一部分用雙縮脲反應(yīng)測定蛋白質(zhì)的含量，剩余部分則用濾紙過濾,，使析出的球蛋白與白蛋白分離,，取出濾液用同一反應(yīng)測定白蛋白的含量?？偟鞍着c白蛋白含量之差即球蛋白的含量,。白蛋白與球蛋白之比即所謂的白／球比值。
3.Folin-酚試劑法
目前實驗室較多用Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量,，此法的特點是靈敏度高,，較雙縮脲高兩個數(shù)量級，較紫外法略高,，操作稍微麻煩,，反應(yīng)約在15分鐘有大顯色，并少可穩(wěn)定幾個小時,，其不足之處是干擾因素較多,，有較多種類的物質(zhì)都會影響測定結(jié)果的準確性。其原理是蛋白質(zhì)中含有酚基的酪氨酸,，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產(chǎn)生蘭色化合物,，顏色深淺與蛋白含量成正比,。
4.考馬氏亮藍G-250
此方法是1976年Bradform建立。染料結(jié)合法測定蛋白質(zhì)的優(yōu)點是靈敏度較高,，可檢測到微量蛋白,，操作簡便、快迅,，試劑配制極簡單,，重復性好，但干擾因素多,?？捡R氏亮藍G－250具有紅色和青色兩種色調(diào)、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色,，當它通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合后,，變成藍色，大吸收波長從465nm轉(zhuǎn)移到595nm處,，在一定的范圍內(nèi),，蛋白質(zhì)含量與 595nm的吸光度成正比，測定595nm處光密度值的增加即可進行蛋白質(zhì)的定量,。
以上便是實驗室中常見的幾種蛋白濃度測定的方法,，另外還有凱氏定氮法和BCA法，有凱氏定氮法結(jié)果,，但操作復雜,，BCA法又以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力較強,，結(jié)果穩(wěn)定,，靈敏度高而受到歡迎,。