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ELISA實驗要點：洗滌是關(guān)鍵
閱讀：919 發(fā)布時間：2019-10-16優(yōu)化ELISA的重點之一在于洗滌,。洗滌步驟可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號,，從而增加分析的信噪比,。每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留,，在后一步產(chǎn)生信號,。而不充分的洗滌會導致差異和高背景，從而帶來不理想的結(jié)果,。本文將為你介紹一些利用自動洗板機來洗滌ELISA平板的技巧,。
免疫分析，比如ELISA,，一般包含兩個或以上的孵育步驟,，中間以洗滌隔開。ELISA通常在96孔板中開展,，其上包被了結(jié)合抗原或抗體,。在封閉步驟后，包被后的平板首先與一抗或抗原孵育。隨后通過一些洗滌步驟去除未結(jié)合（低親和力）的抗原-抗體復(fù)合物,。接著,，平板與二抗孵育。這種帶有酶的抗體與高親和力的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合,。之后,，又是一輪洗滌。后是添加底物并檢測信號,。
我們可使用多種底物來檢測終的抗原-抗體復(fù)合物,。底物分為三類：自然發(fā)光、化學發(fā)光和熒光,。準確說來,，ELISA這個詞指的是使用自然發(fā)光底物的分析。而使用化學發(fā)光底物的分析被稱為Luminescent Immunoassay（LIA）,，使用熒光二抗的分析被稱為Fluorescent Immunoassay（FIA）,。
優(yōu)化ELISA的重點之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號,，從而增加分析的信噪比,。每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留，在后一步產(chǎn)生信號,。而不充分的洗滌會導致差異和高背景,，從而帶來不理想的結(jié)果。本文將為你介紹一些利用自動洗板機來洗滌ELISA平板的技巧,。
洗滌參數(shù)
一些參數(shù)會影響洗滌步驟的效果,。di一個主要的參數(shù)是洗滌量。自動洗板機會分配洗滌液,。如果你之前遭遇過高背景,，那么不要猶豫，將洗滌量調(diào)為高,，是比包被體積更高,。太少的洗滌液會讓一部分分析表面洗滌不到，從而明顯增加背景,。所有反應(yīng)孔的洗滌量必須相同,。ELISA板的商通常會在試劑盒的使用手冊中列出包被量。行業(yè)中通常使用的包被量是200 μl,。如果你的試劑盒也是這樣,，那么商可能會建議使用300 μl洗滌液進行洗滌，以便清潔整個反應(yīng)孔的壁,。一般來說,，洗滌量越高,，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。
洗滌次數(shù)的經(jīng)驗法則
第二個影響洗滌效果的主要參數(shù)是洗滌循環(huán)的量,。當然,，洗滌次數(shù)越多，背景越低,。然而,，太多次的洗滌會降低信號強度，使其難以測定,。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次,。不過，ELISA板的商會對洗滌次數(shù)提出建議,。一般而言,，商包被平板需要的洗滌次數(shù)比用戶包被的平板要少。對于用戶包被的ELISA板,，必須優(yōu)化洗滌次數(shù),。
控制洗滌量和洗滌次數(shù)的另一種方法是加入過量的洗滌液。一般來說,，96孔板的每個孔能容納330至460 μl。不過,，有些自動化洗板機可設(shè)置程序,，分配遠遠超出這個量的洗滌液，比如1 ml,。它是如何做到的呢,？其實很簡單，就是在分液的同時打開吸液功能,。換句話說,，隨著分液器分配更多的液體，抽吸器也將液體吸出,。這種技術(shù)能增加洗滌量,，但不會溢出到其他孔中。
抽吸
另外,，還有一些參數(shù)會影響洗滌步驟的效果,。這些參數(shù)包括吸液高度和吸入位置，這兩者都能調(diào)整,，以降低背景（殘留量）和差異,。
殘留液體中包含未結(jié)合的抗原或抗體，它們會增加背景信號,。殘留量越小,，殘留液體越少，轉(zhuǎn)移到下一步的干擾液體也就越少。
吸液高度會明顯影響殘留量,；如果洗滌吸頭與反應(yīng)孔底部的距離稍大,，那就會讓殘留量急劇增加。反之,，如果洗滌吸頭壓著反應(yīng)孔底部,，那么也會使吸液效率降低，殘留量增加,。
目前的洗板機一般使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動的,。浮動洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動，而剛性洗頭則固定在適當?shù)奈恢?。使用剛性洗頭的洗滌操作在優(yōu)化起來更為復(fù)雜,，因為你需要非常仔細地調(diào)整吸液高度。如果你們實驗室使用幾種不同的板,，那可能會很耗時,。在使用浮動洗頭時，吸頭會降到反應(yīng)孔的底部,。調(diào)整高度就不是很重要,，因此洗頭會下降到底部。
抽吸的位置也對殘留量有著重要影響,；如果每個孔只使用一個抽吸點（這很常見,，因為更快），那么抽吸的位置需要優(yōu)化,。*的位置取決于洗頭的性狀,，但它幾乎不在反應(yīng)孔的中間，即使這是所有洗頭常見的默認位置,。一般來說,，*位置在孔中間與孔壁之間的某處。
反應(yīng)孔的形狀也會影響殘留量,。C形底（平底圓角）的微孔板一般會比那些平底尖角的微孔板殘留量更低,。
如果沒有自動洗板機，采用手工洗滌,，那么也需要注意幾點,。使用8道或12道微量移液器，采用倒吸的方法進行洗滌,；不同廠家的洗液不宜相互混用,。洗板時需保證微孔板平放，將洗滌液注滿各孔,，但盡量避免漏液溢ye,，以每孔300 μl為宜,；板洗次數(shù)一般為3次，要保證洗板的浸泡時間,，每次浸泡時間一般為30-60 秒,；盡量減少洗液殘留量，推薦每次洗板后進行拍板,，并及時更換吸水紙,，避免吸水紙的碎屑粘到反應(yīng)孔內(nèi)。
ELISA看起來很簡單,，但是在實際操作過程中,，也不能掉以輕心，還是應(yīng)該仔細檢查洗滌步驟,，才能獲得準確的結(jié)果,。