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激情盛夏,ELISA法檢測AB含量的方法
閱讀:1487 發(fā)布時間:2018-7-23ELISA),先將ABA蛋白質(zhì)復(fù)合物與固相載體(聚苯乙烯微量滴定板)結(jié)合,然后將待測的ABA(樣品或標(biāo)準(zhǔn)品)和兔抗ABA抗體加入微量滴定板的孔中,進(jìn)行競爭反應(yīng),接著棄去上清液,洗滌固相表面,加入酶標(biāo)二抗使其與結(jié)合在固相ABA上的抗體反應(yīng),后去除多余的未反應(yīng)的酶標(biāo)二抗,測定與固相結(jié)合的酶活性,酶活性和待測ABA含量呈負(fù)函數(shù)關(guān)系,即固相ABA結(jié)合的抗體與酶標(biāo)二抗量(OD或B%)隨待測ABA含量增加而減少,以一系列已知濃度的ABA的OD值制圖而獲得標(biāo)準(zhǔn)競爭性抑制曲線,對于未知樣品B,只要在同樣條件下測定反應(yīng)后的OD值,就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到ABA的量,。
測定方法 ELISA方法是一種固相抗原型酶聯(lián)免疫法(enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
1.包被:在微量滴定板內(nèi)準(zhǔn)確加入100μLABA包被液,,37℃濕盒過夜,。
2.標(biāo)樣稀釋?:取8支試管每管加150μLDB,管中加入50μL(2000ng/50μL)標(biāo)準(zhǔn)液,,充分渦旋后,,取50μL至第二號管中,同樣渦旋后,,取50μL到第三管,;依次稀釋到第六管,稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)ABA依次為1000ng,、500ng,、250ng,、125ng、62.5ng,、31.25ng,、15.625ng、7.8125ng/50μL,。
3. 洗板:從37℃濕盒中取出滴定板,,恢復(fù)到室溫后,,棄去包被液,,用WB(洗滌緩沖液)洗滌三次,甩干(吸水紙),。
4.加樣:1~8孔對應(yīng)加入ABA標(biāo)樣50μL,,10號孔相應(yīng)加入濃ABA標(biāo)樣,9號孔加50μLDB,,三排重復(fù),;然后每孔加50μL抗體,37℃ 45分鐘,。
5.洗板:
6.加酶標(biāo)二抗:每孔加100μL,,37℃反應(yīng)1小時。
7.洗板:
8.顯色:各孔加10μLOPD顯色液,,37℃ 20分鐘,。
9.終止反應(yīng):各孔加50μL 6NH2SO4。
10.讀數(shù):490nm讀取OD值,。其中10號孔調(diào)零,而9號孔為大值(B0),1~8號孔的OD值為B,。
11.結(jié)果計算:以In(B/B0)∕(1-B/B0)為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)ABA濃度的常用對數(shù)(lg[ABA])為橫坐標(biāo),繪制曲線,。
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