本試劑盒應用酶聯(lián)免疫競爭法測定標本中游離脂肪酸（NEFA）水平,。用純化的游離脂肪酸（NEFA）抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中加入游離脂肪酸（NEFA）,，和HRP標記的游離脂肪酸（NEFA）抗原，使它們競爭結(jié)合,，,，經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色。樣本顏色的深淺和樣品中的游離脂肪酸（NEFA）的含量呈負相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標準曲線計算樣品中游離脂肪酸（NEFA）的含量。  

標本要求

1．標本處理：（1）水樣   采集后經(jīng) -20℃反復凍融三次,，再經(jīng)玻璃纖維過濾后,，備查

（2）組織   樣品用丁醇：甲醇：水(5：25：70 V：V：V)抽提，或按相關(guān)文獻提取進行,，提取后應盡快進行實驗,。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存,，備查

2．不能檢測含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1. 加樣：分別設(shè)標準孔,、空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）、待測樣品孔,。在酶標包被板上標準孔中加50微升,，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,。

2. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl,，空白孔除外。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘,。  

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復5次，拍干,。

6. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.

7. 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

8. 測定：以空白孔調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。