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北京北方安道提供——熒光顯微鏡原理
點擊次數(shù)：3024 發(fā)布時間：2011-8-16
熒光顯微鏡原理
北京北方安道科技——顯微鏡專業(yè)供應(yīng)商
王瓊
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熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具,。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光,，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像
（一）光源
現(xiàn)在多采用200W的超高壓汞燈作光源,，它是用石英玻璃制作,，中間呈球形,，內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時由兩個電極間放電,，引起水銀蒸發(fā),，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀*蒸發(fā)時,，可達(dá)50～70個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力,，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果,。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光,，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此,，為熒光顯微鏡普遍采用,。
超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此,，燈室必須有良好的散熱條件,，工作環(huán)境溫度不宜太高。
新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃,，使用一些時間后,，則需要高壓啟動（約為15000V），啟動后,，維持工作電壓一般為50～60V,，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命,，在每次使用2h的情況下約為200h，開動一次工作時間愈短，則壽命愈短,，如開一次只工作20min,，則壽命降低50%。因此,，使用時盡量減少啟動次數(shù),。燈泡在使用過程中，其光效是逐漸降低的,。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動,。點燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不*而損壞電極,，一般需要等15min,。由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線強(qiáng)烈,，因此燈泡必須置燈室中方可點燃,，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時造成操作。
超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓,、鎮(zhèn)流,、啟動幾個部分。在燈室上有調(diào)節(jié) 燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng),，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡,，前面安裝有集光透鏡。
國產(chǎn)超高壓汞燈GCQ-200型性能良好,，可以代替HBO-200等型的進(jìn)口燈泡,，平均壽命在200h以上，價格也比較低,。
我國研制的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置,，體積小，重量輕,，功率小,，交、直流兩用（自帶直流電源）,，易于攜帶,，使用方便，已推廣應(yīng)用,。
（二）濾色系統(tǒng)
濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位,，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號,，各廠家名稱常不統(tǒng)一,。濾板一般都以基本色調(diào)命名,，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃,，數(shù)字代表型號特點,。如德國產(chǎn)品（Schott）BG12，就是種藍(lán)色玻璃,，B是藍(lán)色的*個字母,，G是玻璃的*個字母；我國產(chǎn)品的名稱已統(tǒng)一用拼音字母表示,，如相當(dāng)于BG12的藍(lán)色濾板名為QB24,，Q是青色（藍(lán)色）拼音的*個字母，B是玻璃拼音的*個字母,。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名,，如K530，就是表示壓制濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光,。還有的廠家的濾板*以數(shù)字命名,，如美國Corning廠的NO：5-58，即相當(dāng)于BG12,。
1．激發(fā)濾板 根據(jù)光源和熒光色素的特點,，可選用以下三類激發(fā)濾板，提供一定波長范圍的激發(fā)光,。
紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過,，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5,，外加一塊BG-38,，以除去紅色尾波。
紫外藍(lán)光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過,。常用型號為ZB-2或ZB-3,，外加BG-38。
紫藍(lán)光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過,。常用型號為QB24（BG12）,。
zui大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達(dá)明色素）可用藍(lán)綠濾板（如B-7）激發(fā)。
近年開始采用金屬膜干涉濾板,，由于針對性強(qiáng),，波長適當(dāng)，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好,。如西德Leitz廠的FITCKP490濾板和羅達(dá)明的S546綠色濾板,，均遠(yuǎn)比玻璃濾板效果好。
激發(fā)濾板分薄厚兩種,，一般暗視野選用薄濾板,，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些,。基本要求是以獲得zui明亮的熒光和的背景為準(zhǔn),。
2．壓制濾板 壓制濾板的作用是*阻擋激發(fā)光通過,，提供相應(yīng)濾長范圍的熒光,。與激發(fā)濾板相對應(yīng),，常用以下3種壓制濾板：
紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過,。能與UG-1或UG-5組合,。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫藍(lán)光壓制濾板：能通過510nm以上濾長的熒光（綠到紅）,，能與BG-12組合,。通常用OG-4K510或OG-1K530。
紫外紫光壓制濾板：能通過460nm以上波長的熒光（藍(lán)到紅）,，可與BG-3組合,，常用OG-11K470AK 490，K510,。
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反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見光的藍(lán)紫區(qū)吸收少,，反射達(dá)90%以上,，而銀的反射只有70%；一般使用平面反光鏡,。
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專為熒光顯微鏡設(shè)計制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種,。還有相差熒光聚光器,。
1．明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強(qiáng),，使用方便,，特別適于低、中倍放大的標(biāo)本觀察,。
2．暗視野聚光器 暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛,。因為激發(fā)光不直接進(jìn)入物鏡，因而除散射光外,，激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡,，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強(qiáng)激發(fā)光的強(qiáng)度,，壓制濾板也可以很薄,，因紫外光激發(fā)時,，可用無色濾板（不透過紫外）而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強(qiáng)了熒光圖像的亮度和反襯度,，提高了圖像的質(zhì)量,，觀察舒適，可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒,。
3．相差熒光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用,，可同時進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀察，既能看到熒光圖像,，又能看到相差圖像,，有助于熒光的定位準(zhǔn)確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器,。
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各種物鏡均可應(yīng)用，但用消色差的物鏡,，因其自體熒光極微且透光性能（波長范圍）適合于熒光,。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數(shù)成反比,，所以為了提高熒光圖像的亮度,，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大 時其影響非常明顯,。因此對熒光不夠強(qiáng)的標(biāo)本,，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡（4×,5×,，6.3×等）,。
（六）目鏡
在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡,，如5×和6.3×,。過去多用單筒目鏡，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上,，但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡,，觀察很方便。
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新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后,，波長短的部分（紫外和紫藍(lán)）由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當(dāng)濾鏡對向光源呈45,。傾斜時,，則垂直射向物鏡，經(jīng)物鏡射向標(biāo)本,，使標(biāo)本受到激發(fā),，這時物鏡直接起聚光器的作用,。同時，濾長長的部分（綠,、黃,、紅等），對濾鏡是可透的,，因此,，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用,，由于標(biāo)本的熒光處在可見光長波區(qū),，可透過濾鏡而到達(dá)目鏡觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高,，在高放大時比透射光源強(qiáng)。它除具有透射式光源的功能外,，更適用于不透明及半透明標(biāo)本,，如厚片、濾膜,、菌落,、組織培養(yǎng)標(biāo)本等的直接觀察。近年研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置,，稱之為落射熒光顯微鏡,。
二、使用熒光顯微鏡的注意事項
?。?）嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作,，不要隨意改變程序。
?。?）應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查,。進(jìn)入暗室后，接上電源,，點燃超高壓汞燈5～15min,，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛*適應(yīng)暗室,，再開始觀察標(biāo)本,。
（3）防止紫外線對眼睛的損害,，在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡,。
（4）檢查時間每次以1～2h為宜,，超過90min,，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降,，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3～5min后,，熒光也明顯減弱,；所以，zui多不得超過2～3h,。
?。?）熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查,，以節(jié) 省時間,，保護(hù)光源。天熱時,，應(yīng)加電扇散熱降溫,，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時,，須待燈泡充分冷卻后才能點燃,。一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。
?。?）標(biāo)本染色后立即觀察,，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,，可延緩熒光減弱時間,，防止封裱劑蒸發(fā)。
?。?）熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般分為四級,，即“一”—無或可見微弱熒光。“+”—僅能見明確可見的熒光,。“++”—可見有明亮的熒光,。“+++”—可見耀眼的熒光。
三,、熒光圖像的記錄方法
熒光顯微鏡所看到的熒光圖像,，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度,，在判斷結(jié)果時,，必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo),，即憑工作者目力觀察,。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展,，在不同程度上采用客觀指標(biāo)記錄判斷結(jié)果,，如用細(xì)胞分光光度計，圖像分析儀等儀器,。但這些儀器記錄的結(jié)果,，也必須結(jié)合主觀的判斷。
熒光顯微鏡攝影技術(shù)對于記錄熒光圖像十分必要,，由于熒光很易褪色減弱,，要即時攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同,。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24,。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大,，如FITC的標(biāo)記物,，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%,。所以,，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來,。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統(tǒng)裝置。
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