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細(xì)胞培養(yǎng)需要提供合適的溫度和氣體環(huán)境,，因此一般采用培養(yǎng)箱的形式來滿足細(xì)胞培養(yǎng)的要求。

 

細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟：

 

1,、細(xì)胞復(fù)蘇

 

將凍存細(xì)胞從液氮中取出后,，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進(jìn)其融化。移人15ml離心管中,，加入10ml預(yù)熱的DMEM*培養(yǎng)基,，輕輕吹勻，離心,，2000rpmX2min,，棄上清液,。

 

加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗,，棄上清液。加入10ml DMEM*培養(yǎng)基,，輕輕吹打,，接種于10cm盤中，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

 

2,、細(xì)胞傳代

 

細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)．去培養(yǎng)基,，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶,，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min,。加人1ml DMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管,。

 

加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min,，棄上清液,。再加入10ml PBS（經(jīng)高壓滅菌，保存于40C）,，吹勻,，吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照1×106/盤接種,，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),。

 

3、細(xì)胞凍存

 

細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí),，去培養(yǎng)基,，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min,。加入lmlDMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管,。加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min,，棄上清液,。

 

加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO）,，放入凍存盒內(nèi)（盒內(nèi)有異丙醇,，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內(nèi),，過夜,，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年,，如不放人液氮,，可以保存三個(gè)月,。