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 1 試劑空白

試劑空白吸光度是反映試劑質(zhì)量的指標(biāo)之一。每種試劑都有一定的空白吸光度范圍,，試劑空白吸光度的改變往往提示該試劑的變質(zhì),；如利用Trinder反應(yīng)為原理的檢測試劑會因含酚類物質(zhì)被氧化為醌而變?yōu)榧t色。堿性磷酸酶,、r一谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶,、淀粉酶等檢測試劑會因基質(zhì)分解出硝基酚或酚基苯胺而變黃。有些試劑久置后變渾濁,。這些情況均可使空白吸光度升高,。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等負(fù)反應(yīng),，在放置過程中其試劑空白吸光度會因NADH自行氧化為NAD+而下降,。原則上，吸光度上升的反應(yīng),，其試劑空白吸光度越低越好,，不能超過一個高限；相反,，吸光度下降的反應(yīng),，其試劑空白吸光度不能低于一個低限。因此,，試劑空白吸光度限值,，常作為程序參數(shù)輸入儀器，如經(jīng)核查超限,，儀器會自動報警,，提示更換試劑。需要指出的是,，還原型輔酶I（或II）等投料量不足或劣質(zhì)的原料,，往往需要加大用量，才使“表觀”吸光度上升,，湊合過試劑空白核對的“關(guān)”,，其后果為如下情況：

1．1 線性范圍變窄 現(xiàn)象：高值測不高。原因：生產(chǎn)試劑時有效成分投料量不足,；試劑成份穩(wěn)定性較差,。

1．2 靈敏度變低現(xiàn)象：酶促反應(yīng)速度曲線斜率下降,，測定結(jié)果有嚴(yán)重系統(tǒng)誤差。原因：試劑底物濃度不足,。

1．3 低值偏高 現(xiàn)象：試劑空白的變化曲線（吸光度VS時間）明顯波動,。原因：試劑自身不穩(wěn)定，自行分解,；工具酶純度不夠,，雜酶含量超限，導(dǎo)致干擾作用,。

2 樣品信息

樣品的溶血,、脂血、黃疸等會對測定結(jié)果產(chǎn)生非化學(xué)反應(yīng)的干擾,。因此,，應(yīng)根據(jù)溶血、脂濁,、黃疸的光譜吸收特性,，采用雙波長或多波長的檢測模式，并在結(jié)果計算中扣除因溶血,、脂血,、黃疸引起的影響，減少干擾程度,。

3 測定范圍

每種待測物都有一個可測定的濃度或活性范圍,，樣品結(jié)果若超過此范圍，分析儀將顯示結(jié)果超過范圍的提示,。表示試劑已經(jīng)變質(zhì),，應(yīng)更換合格試劑。

4 底物耗盡

使用連續(xù)監(jiān)測法,、兩點法測定酶活性時，若酶活性非常高,，底物接近被耗盡,，吸光度上升或下降會超過某一吸光度變化范圍，監(jiān)測期的吸光度將偏離線性,，使測定結(jié)果不可靠,。

5 酶的預(yù)活化

測定血清中的某些酶，如CK,，離體（采血）后很容易失活,。失活的原因是酶活性中心的活性基因巰基（一SH）被氧化造成的。只有通過適當(dāng)?shù)倪€原作用才能重新激活,。如CK—NAC試劑盒即含有CK活化劑,，名為N一乙酰半胱氨酸。實驗研究證明，NAC對血清中已失活的CK活化過程約需180 S,。這就是CK測定為什么要延遲時間較長的理論依據(jù),。在AST，ALT采用IFCC推薦方法測定時需要磷酸吡哆醛預(yù)活化,。需要強(qiáng)調(diào)：含有活化劑的生化試劑,，其測定酶活性的結(jié)果要高些。

6 校準(zhǔn)與結(jié)果溯源性

酶的校正：要滿足在同一方法學(xué),、同一測定條件,、與理論計算的FACTOR值差異不大，沒有發(fā)現(xiàn)有明顯影響因素,，方可進(jìn)行校正,。

檢驗結(jié)果溯源性，得建立一個可靠的參考系統(tǒng)作為準(zhǔn)確性基礎(chǔ),，然后將準(zhǔn)確性轉(zhuǎn)移到常規(guī)方法測定中去,，使常規(guī)方法測定結(jié)果可溯源到參考系統(tǒng)所提供的準(zhǔn)確性基礎(chǔ)上來。在實現(xiàn)溯源性目標(biāo)過程中,，永遠(yuǎn)以患者新鮮標(biāo)本為實驗對象,，以方法學(xué)對比試驗方法為驗證手段。方法學(xué)對比試驗常采用回歸方程進(jìn)行統(tǒng)計分析,，假如斜率接近1,，截距較小，這意味著實驗室常規(guī)方法對標(biāo)本測定結(jié)果和溯源目標(biāo)參考系統(tǒng)對標(biāo)本檢測結(jié)果非常接近,。

臨床化學(xué)中參考標(biāo)準(zhǔn)（二級標(biāo)準(zhǔn)）要有通用性,，但生產(chǎn)廠家提供的校準(zhǔn)液并非通用的，只適用于某一特定的分析系統(tǒng),。

校準(zhǔn)液標(biāo)示值往往是按其基質(zhì)偏差修正的,，所以標(biāo)示值并非實際值。校準(zhǔn)液,、質(zhì)控血清通常是經(jīng)過處理的混合人或動物血清,，這種制備物在特定分析系統(tǒng)中往往與人新鮮血清反應(yīng)性不同而產(chǎn)生基質(zhì)偏差。如總膽固醇測定基質(zhì)效應(yīng)研究指出：校準(zhǔn)液酶法測定回收結(jié)果偏低可達(dá)5%~7%,。

7 試劑抗干擾作用的合理性有些液體雙試劑,，其實質(zhì)并不真正具備抗干擾的能力而只是解決了試劑的液體化和穩(wěn)定性問題。如,，ALT試劑盒中,，NADH在pH7.5~7.8水溶液中極不穩(wěn)定，在pH>8.7時才能穩(wěn)定保存,。因此,，為了保證試劑穩(wěn)定性,，液體雙試劑的R1需要維持pH>8.7，但此時LDH活性大大下降,，就失去消除內(nèi)源性丙酮酸的功能,，只有加入試劑R2后，反應(yīng)混合液的pH下降至LDHzui適pH,，在經(jīng)過延遲時間60 S后,，才能消除內(nèi)源性丙酮酸的干擾。再如,，Tfinder反應(yīng)中抗Vc干擾問題：由于維生素c易氧化,，樣品中Vc會競爭反應(yīng)生成的過氧化氫，而產(chǎn)生負(fù)干擾,。因此,，在試劑R1中加入抗壞血酸氧化酶，這種方法是有效的,，但不一定有很大的意義,。因為Vc干擾必須同時具備二個條件：a）Vc攝入量較多；b）采血后立即測定,。實驗表明離體血清中Vc在90 min后會全部被氧化,。又如，使用胺類新色原,。a）分子共軛結(jié)構(gòu)特性使得靈敏度提高,，相應(yīng)可以減少樣本用量，zui終能有效地降低干擾物的量．b）使生成胺類色素原zui大吸收峰由500~520 nm移至550 nm以上,，以避開黃疸,、溶血干擾。如：亞鐵一H 0 ,，能有效避免黃疸干擾的理論依據(jù)是亞鐵與H,。0。親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于膽紅素,。甘油三酯測定,，有人主張選用雙試劑方法消除內(nèi)源性甘油，這個方法是可行的,，但忽視了一個化學(xué)平衡理論。因為所有的酯在水溶液中都不是簡單地以酯的形式存在,，而是以水解與酯化相平衡的形式存在,。在一個平衡體系中，如果去除游離甘油,，這個平衡就向生成甘油方向移動,，甘油三酯就會重新水解,，生成新的甘油，達(dá)到新的平衡,，因此樣品與R1試劑孵育時間越長,，測得甘油三酯值就越低。甘油三酯測定,，不僅要去除游離甘油,，而且還要克服樣本含量真實性發(fā)生的變化，試劑中必須加入甘油激酶,，并且延遲時間要標(biāo)準(zhǔn)化,。所以，一些試驗項目在消除內(nèi)源性物質(zhì)干擾的同時,，會帶來樣品含量真實性的變化,。