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遷移實驗（cell migration assay）
實驗材料
（1）ThinCert插入式細胞培養(yǎng)器: 24-well, 8.0-μm pore membranes （Greiner662638）
（2）細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：無血清培養(yǎng)基，10％血清培養(yǎng)基，PBS,，0.02％EDTA
（3）固定液：甲醇
（4）染色液：Giemsa染液
（5）封片劑：中性樹膠
（6）其他：小鑷子，棉棒,，載玻片,，蓋玻片
操作步驟
（1）所有細胞培養(yǎng)試劑和ThinCert放在37℃溫育；
（2）待測細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,，消化細胞,，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，
用無血清培養(yǎng)基懸浮細胞,，計數(shù),，調(diào)整濃度 為2×105 /ml；
（3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl 含10％血清的培養(yǎng)基,，上 室加入100－
150μl細胞懸液,，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24小時；
（4）用鑷子小心取出ThinCert,，吸干上室液體,，移到預先加入約800μl甲醇的孔中,，室溫固定30分鐘；
（5）取出ThinCert,，吸干上室固定液,，移到預先加入約800μl Giemsa染液 的孔中，室溫染色15－30分鐘,；
（6）輕輕用清水沖洗浸泡數(shù)次,，取出ThinCert，吸去上室液體,，用濕棉棒小 心擦去上室底部膜表面上的細胞,；
（7）用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干,，移至載玻片上用中性樹膠封片,；
（8）顯微鏡下取9個隨機視野計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果,。
注意事項
（1）根據(jù)待測細胞體積大小選擇合適孔徑的ThinCert,。常用的為8.0-μm孔徑（如
AGS細胞），如果細胞體積較大可以考慮用10-μm孔徑,；
（2）根據(jù)待測細胞的遷移能力強弱調(diào)整細胞數(shù)和遷移時間,。常規(guī)24-well ThinCert接種細胞數(shù)約
為2≈5×104/well， 遷移時 間 12≈36小時,；
（3）由于Greiner公司的24-Transwell內(nèi)含24個獨立的ThinCert,，為了避免操作污染，
每次實驗可預先另準備一塊24孔普通培養(yǎng)板（Greiner）,；
（4）如果細胞遷移能力較弱,，下室液體可用3T3細胞無血清培養(yǎng)24小時獲得 的上清加50μg/ml FN（Fibronectin），
具體可查 閱相關(guān)文獻,；
（5）細胞懸液加入膜中央,，盡量保證液面水平；
（6）固定染色擦洗時動作小心,，避免擦去膜底面的細胞。但一定要充分擦凈膜 表面上未遷移的細胞,，
以免影響讀數(shù),。尤其是 膜周邊上可用細牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗，但要小心避免將膜戳破,；
（7）Chamber和膜上都無法標記,，操作時應小心避免混淆實驗組和對照組；
（8）充分晾干,，避免殘留水分導致鏡下聚焦不一致,。
