您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的力康解決方案,，助力生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)意義及應(yīng)用
細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無菌、適宜溫度,、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等）,，使之生存、生長,、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法,。細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),。
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)研究方法中重要和常用技術(shù),，通過細(xì)胞培養(yǎng)既可以獲得大量細(xì)胞，又可以借此研究細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的合成代謝,、細(xì)胞的生長增殖等,。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在整個生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起核心作用，現(xiàn)代的生物技術(shù)一般包括基因工程技術(shù),、細(xì)胞工程技術(shù),、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)，這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細(xì)胞培養(yǎng)密切相關(guān),。
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域
01,、基礎(chǔ)研究
如藥物作用機(jī)理、基因功能,、疾病發(fā)生機(jī)理等研究
02,、藥物研究開發(fā)
如新藥篩選、疫苗,、基因工程藥物,，細(xì)胞工程藥物，研究與開發(fā),，單克隆抗體制備等
03,、疫苗生產(chǎn)
如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）,、多肽疫苗（腫瘤疫苗）等
04,、基因工程藥物生產(chǎn)
如EPO等，抗體藥物,、基因治療藥物生產(chǎn)
05,、細(xì)胞工程藥物生產(chǎn)
生物細(xì)胞內(nèi)的一些生物活性多肽、生物活性物質(zhì),，如蛋白質(zhì)等,，預(yù)測其在體內(nèi)的藥效和替代體內(nèi)法檢測其成品的生物活性
HEK293懸浮培養(yǎng)，力康設(shè)備解決方案為參考
今天,，采用力康相關(guān)設(shè)備的解決方案作為參考,，以“二氧化碳恒溫振蕩器中進(jìn)行HEK293懸浮培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)流程”為例，小編為大家奉上一篇干貨滿滿的細(xì)胞培養(yǎng)知識盛宴,。
此類哺乳動物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中,，培養(yǎng)基成本較高、生長條件較為復(fù)雜,、生長周期較長,、對剪切力和培養(yǎng)環(huán)境較為敏感，是較為典型的高要求細(xì)胞培養(yǎng)案例,。
細(xì)胞培養(yǎng)可分為動物細(xì)胞培養(yǎng),、植物細(xì)胞培養(yǎng),、微生物細(xì)胞培養(yǎng)，其中,，最困難的是動物細(xì)胞培養(yǎng),。動物細(xì)胞培養(yǎng)所要求的體外培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)條件較高，因此,，對實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的要求也較高,。
用于細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)設(shè)備很多，比如：生物安全柜,、超凈工作臺,、高速冷凍離心機(jī)、醫(yī)用低溫保存箱,、二氧化碳培養(yǎng)箱,、二氧化碳恒溫振蕩器、生物反應(yīng)器,、超純水系統(tǒng)等,，這些設(shè)備的品質(zhì)在某種程度上決定了細(xì)胞培養(yǎng)的效果。
實(shí)驗(yàn)流程（僅供參考）
一,、細(xì)胞馴化
（1）直接馴化：大部分情況下,，培養(yǎng)于原培養(yǎng)基中的細(xì)胞，可以直接適應(yīng)目標(biāo)培養(yǎng)基,，只要按照日常傳代方式（稀釋）更換培養(yǎng)基即可,。
1、原培養(yǎng)基中的細(xì)胞,，直接稀釋傳代到目標(biāo)培養(yǎng)基中,，細(xì)胞密度控制在0.3~0.4×106cells/ml
2、將細(xì)胞置于37℃,，5%CO2,，轉(zhuǎn)速為110~175rpm的二氧化碳恒溫振蕩器中進(jìn)行培養(yǎng)
3、4~6天后對細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋（或者離心800rpm,，3~5min更換上清），保持稀釋（或者離心）后細(xì)胞密度為0.3~0.4×106cells/ml
4,、經(jīng)過在100%的目標(biāo)培養(yǎng)基中的幾次傳代培養(yǎng),，傳代后4~6天細(xì)胞的密度可以達(dá)到2~3×106cells/ml，細(xì)胞活率＞90%,。這說明細(xì)胞已經(jīng)適應(yīng)了目標(biāo)培養(yǎng)基,，之后進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)時，細(xì)胞的起始密度可以降到0.2~0.3×106cells/ml左右
（2）漸進(jìn)式馴化：注意：選用低代次,，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行馴化,。
1,、原培養(yǎng)基中復(fù)蘇細(xì)胞并繼續(xù)使用該培養(yǎng)基傳代2~3次至細(xì)胞生長穩(wěn)定，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2~3×106cells/ml后進(jìn)行傳代,，傳代后細(xì)胞密度控制在0.5~0.6×106cells/ml,，5~10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或原無血清培養(yǎng)基與目標(biāo)培養(yǎng)基的比例為75:25
2、將細(xì)胞置于37℃,，5%CO2,，轉(zhuǎn)速為110~175rpm的恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng)
3、當(dāng)細(xì)胞密度3~4天后達(dá)到3×106cells/ml且細(xì)胞活率>90%,，傳代時5~10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或原無血清培養(yǎng)基與目標(biāo)培養(yǎng)基的比例為 50:50,細(xì)胞密度控制0.5~0.6×106cells/ml
注：如細(xì)胞生長慢,，可離心上清，留20%培養(yǎng)基,，加入80%的5~10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或原無血清培養(yǎng)基與目標(biāo)培養(yǎng)基比例為75:25的混合培養(yǎng)基,，繼續(xù)培養(yǎng)；再下次傳代時重復(fù)步驟③
4,、重復(fù)步驟③逐步增加目標(biāo)培養(yǎng)基所占的比例（5~10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或原無血清培養(yǎng)基與目標(biāo)培養(yǎng)基的比例為25:75至10:90）直到100%的目標(biāo)培養(yǎng)基
5,、經(jīng)過在100%的目標(biāo)培養(yǎng)基中的幾次傳代培養(yǎng)，傳代后3~4天細(xì)胞的密度可以達(dá)到2~3×106cells/ml,，細(xì)胞活率＞90%,，這說明細(xì)胞已經(jīng)適應(yīng)了目標(biāo)培養(yǎng)基。之后進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)時,，細(xì)胞的起始密度可以降到0.2~0.3×106cells/ml,，一般傳代2~3次后再進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。注意：一般細(xì)胞馴化過程中,，前三代細(xì)胞的狀態(tài)可能不是很好,，但一般從第四代狀態(tài)會有改善
二、細(xì)胞復(fù)蘇
1,、迅速取出凍存的細(xì)胞,，在37℃水浴條件下進(jìn)行解凍（可以將離心管在水中輕輕晃動，時間控 制在60s以內(nèi)）
2,、輕輕地混勻細(xì)胞并將融化的細(xì)胞全部移至 15ml（或 50ml）無菌離心管中（用培養(yǎng)基沖洗幾次凍存管）,，逐滴加入5~8ml預(yù)熱到37℃的目標(biāo)培養(yǎng)基
3、離心換液（800rpm,，3~5min）去除全部上清,，加入預(yù)熱新鮮目標(biāo)培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至125ml搖瓶內(nèi)（用培養(yǎng)基沖洗幾次離心管）,，最終達(dá)到25~40ml,，使得細(xì)胞密度達(dá)到0.4~0.6×106cells/ml
4、將細(xì)胞置于37℃,，5%CO2,，轉(zhuǎn)速為110~175rpm的二氧化碳恒溫振蕩器中進(jìn)行培養(yǎng)
5,、2~3天后通過人工或儀器測定細(xì)胞的密度及活率，若細(xì)胞密度達(dá)到2.0×106cells/ml,，活率達(dá)到85%以上則可進(jìn)行傳代培養(yǎng)
6,、如果細(xì)胞密度低于1.0×106cells/ml，則建議對細(xì)胞進(jìn)行離心（800rpm,，5min）,，然后重懸于20~30ml的新鮮培養(yǎng)基中使得細(xì)胞密度為0.4~0.6×106cells/ml左右，并繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞正常生長則可進(jìn)行傳代培養(yǎng)
三,、細(xì)胞傳代
1,、取細(xì)胞培養(yǎng)樣品，人工或儀器測定細(xì)胞密度以及活率
2,、原培養(yǎng)基中的細(xì)胞,，直接稀釋傳代到目標(biāo)培養(yǎng)基中，細(xì)胞密度控制在0.3~0.4×106cells/ml
3,、恢復(fù)活力的標(biāo)準(zhǔn)：活率＞95%,，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則圓整，生長倍增時間正常
4,、將細(xì)胞置于37℃,，5%CO2，轉(zhuǎn)速為110~175rpm的二氧化碳恒溫振蕩器中進(jìn)行培養(yǎng),，2~3天傳代一次
四,、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
細(xì)胞轉(zhuǎn)染在目標(biāo)培養(yǎng)基中，采用商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑（例如Gibco293Fectin™,、ExpiFectamine™293,、TransfectionKit）或PEI（線性化聚乙酰亞胺），可以實(shí)現(xiàn)對 HEK293 細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染,，具體操作可參考所購買轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。
1、轉(zhuǎn)染前一天按照2.0×106cells/ml密度接種,，培養(yǎng)第二天細(xì)胞密度可至4.0×106cells/ml左右
2,、培養(yǎng)第二天，細(xì)胞計(jì)數(shù)后,，細(xì)胞活率＞95%,，活細(xì)胞密度≥4.0×106cells/ml，可直接使用,；若細(xì)胞密度低于4.0×106cells/ml，可通過離心（800rpm,，3~5min）收集細(xì)胞,，將細(xì)胞以 4.0×106cells/ml密度重懸于目標(biāo)培養(yǎng)基中 注：如果后期進(jìn)行≥6天的瞬轉(zhuǎn)表達(dá)同時不添加補(bǔ)料和葡萄糖,，建議瞬轉(zhuǎn)時密度控制在 2.0~3.0×106cells/ml
3、按照優(yōu)化后的瞬轉(zhuǎn)工藝,，以20ml體系單抗使用PEI轉(zhuǎn)染為例,，制備DNA和PEI混合液
①配制A、B液,，渦旋混勻后室溫靜止5min
②A：20ug質(zhì)粒+600ul（培養(yǎng)基或PBS）
③B：80ugPEI+600ul（培養(yǎng)基或PBS）,，進(jìn)行0.22um抽濾
④將A液加入到B液中輕輕吹打混勻，室溫靜置15min
4,、將混合液加入到培養(yǎng)液中,，進(jìn)行培養(yǎng)
5、大于6天的培養(yǎng)時間,，建議在20小時后加≤5%補(bǔ)料（也可再額外加入＜5g/l葡萄糖）加入培養(yǎng)基,，可進(jìn)一步提高活細(xì)胞密度和蛋白表達(dá)量。如果條件允許,，可以檢測殘?zhí)?，控制殘?zhí)菨舛仍?~6g/l，效果更佳
6,、培養(yǎng)至活力低于60%,，結(jié)束培養(yǎng)。此步驟可以直接轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá),，也可得到腺病毒（lentivirus表達(dá)系統(tǒng)）再進(jìn)行病毒感染表達(dá)蛋白
五,、細(xì)胞感染
1、按一定比例混合病毒和293細(xì)胞,，進(jìn)行感染
2,、將細(xì)胞放置在37℃溫度，5%CO2濃度,，轉(zhuǎn)速為110~175rpm的二氧化碳恒溫振蕩器中進(jìn)行培養(yǎng)
六,、細(xì)胞凍存
1、凍存細(xì)胞時,，要選擇處于對數(shù)生長期同期細(xì)胞在90%以上的細(xì)胞活率,，一般建議凍存密度為 5~10×106cells/ml
2、事先計(jì)算好凍存的細(xì)胞管數(shù)和所用的培養(yǎng)基的體積
3,、制備細(xì)胞凍存液：90%目標(biāo)培養(yǎng)基+10%DMSO混合液存放在4℃,，一般為當(dāng)天用當(dāng)天制備
4、對細(xì)胞樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)
5,、以800rpm,，3~5min的條件離心收集細(xì)胞，然后用凍存培養(yǎng)基（4℃）重懸細(xì)胞
6,、取樣計(jì)數(shù),，調(diào)整細(xì)胞密度,，使得細(xì)胞密度為 5~10×106cells/ml，迅速分裝細(xì)胞到無菌的凍存管中,，一般2ml的凍存管加入1~1.5ml細(xì)胞懸液,，貼好標(biāo)簽，密封
7,、將細(xì)胞凍存管放到程序降溫凍存盒（注意填充異丙醇,，4℃預(yù)冷）中，置于-80℃冰箱（每分鐘下降1℃）,，過夜存放后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中進(jìn)行保存,。（注意：降溫一定需要梯度降溫：可4℃1h、-20℃2~4h,，-80℃過夜,，最后放入液氮長期儲存。）
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),，力康實(shí)驗(yàn)室相關(guān)設(shè)備
Smart Plus 超純水系統(tǒng)
在上述實(shí)驗(yàn)流程中,，細(xì)胞培養(yǎng)基干粉調(diào)制制備、細(xì)胞馴化過程中細(xì)胞培養(yǎng)液的稀釋,、細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中轉(zhuǎn)染試劑的制備等步驟,，均需使用純水或超純水，在實(shí)驗(yàn)過程中經(jīng)常被忽略的蒸發(fā)盤,、水庫,、水盤，用來維持培養(yǎng)環(huán)境中的濕度,，如果使用的純水或超純水不達(dá)標(biāo)或蒸發(fā)盤,、水庫、水盤長期沒有清洗,，水中的雜質(zhì)可能會擴(kuò)散到培養(yǎng)環(huán)境中,，從而影響細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果。所以,，實(shí)驗(yàn)室純水和超純水系統(tǒng)的選擇尤為重要,。
力康Smart Plus超純水系統(tǒng)為您的實(shí)驗(yàn)提供滿足《GB/T 33087-2016 儀器分析用高純水規(guī)格及試驗(yàn)方法》、《GB/T 6682-2008 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法》,、《GB/T 11446電子級超純水中國國家標(biāo)準(zhǔn)》等標(biāo)準(zhǔn)的純水或超純水,，助力您的實(shí)驗(yàn)研究取得圓滿成功。
高速冷凍離心機(jī)
在上述實(shí)驗(yàn)流程中,，細(xì)胞馴化,、復(fù)蘇、轉(zhuǎn)染、凍存,、細(xì)胞培養(yǎng)液的離心,，均需使用高速冷凍離心機(jī)。如果細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的目的是產(chǎn)物表達(dá),，那么對溫度敏感性的產(chǎn)物，例如在低溫條件下才能保持活性的蛋白質(zhì),，離心過程中必須使用冷凍離心機(jī),，從而保障在實(shí)驗(yàn)步驟中，維持產(chǎn)物的活性,，獲得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
力康高速冷凍離心機(jī)，為您提供穩(wěn)定的運(yùn)行工況,、智能升降溫控制,、智能轉(zhuǎn)子識別技術(shù)、電子式平衡裝置,，可滿足細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)需求,。其出色的產(chǎn)品功能為您節(jié)省寶貴的時間，保護(hù)您珍貴的實(shí)驗(yàn)樣品,，助您盡快獲得研究成果,。
醫(yī)用低溫保存箱
在上述實(shí)驗(yàn)流程中，在細(xì)胞凍存過程中,，需使用醫(yī)用低溫保存箱,，保存箱的穩(wěn)定性較為重要，如果出現(xiàn)局部失溫或溫度異常,，以及凍存操作不標(biāo)準(zhǔn)或系統(tǒng)故障,，珍貴的細(xì)胞種子樣本極有可能失活。
力康低溫冷鏈產(chǎn)品涵蓋2-8℃冷藏保存箱,、-25℃低溫保存箱,、-40℃低溫保存箱和-86℃低溫保存箱，擁有多種容積規(guī)格可選,，雙機(jī)復(fù)疊制冷,，智能觸屏操作、可選雙獨(dú)立系統(tǒng)主機(jī),、多重報警系統(tǒng),、采用第二代VIP技術(shù)、采用*低噪音技術(shù)等特點(diǎn),，產(chǎn)品可用于保存病毒,、細(xì)菌樣本、疫苗、生物組織及器官特殊食品,、藥品,、材料等，為您的實(shí)驗(yàn)室研究提供穩(wěn)定,、理想的儲存環(huán)境,。
力康集團(tuán)深耕醫(yī)療器械和生命科學(xué)領(lǐng)域三十余年，專注于提供多樣化,、多場景的臨床醫(yī)療和實(shí)驗(yàn)室整體解決方案,，包括智慧數(shù)字一體化手術(shù)室、數(shù)字化麻醉重癥,、數(shù)字化實(shí)驗(yàn)室,、數(shù)字化新生兒科、數(shù)字化康復(fù)中心,、數(shù)字化醫(yī)療及實(shí)驗(yàn)室信息管理以及數(shù)字化遠(yuǎn)程醫(yī)療整體解決方案等,。
未來，力康將繼續(xù)為用戶提供智能化,、數(shù)字化,、 人性化的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，滿足現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用需求,，提供各類解決方案和專業(yè)化服務(wù),。