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熒光定量PCR操作中有哪些事項要注意的呢,？
閱讀：3774 發(fā)布時間：2020-8-11
熒光定量PCR技術(shù),，是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光報告系統(tǒng)，利用熒光信號的變化對PCR過程進(jìn)行實時監(jiān)控,，實現(xiàn)對起始模板的定量檢測,。
熒光定量PCR屬于精密性試驗，需要專業(yè)人員操作,，在操作過程中需要注意各方面細(xì)節(jié)實驗以保證實驗的可靠可重復(fù)性,。
1,、熒光定量PCR操作注意點：
實驗室注意分區(qū)：試劑準(zhǔn)備間，樣本處理間,，PCR室,，電泳間要有明確區(qū)分，各房間實驗室的實驗服不得混用,；
試劑準(zhǔn)備間及樣本處理間不處理實驗相關(guān)的高濃度的核酸模板（如高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,，PCR產(chǎn)物，miRNA的minics等）,；
減少頻繁多次的走動,，尤其去過電泳間之后當(dāng)天不可進(jìn)入其他房間；
使用生物安全柜加樣,，不同位置的移液器不可混用,，不要隨意更換其位置；
在檢測體系中添加UNG酶系統(tǒng)用于避免PCR產(chǎn)物的污染,。
2,、試劑質(zhì)量控制：
對每批次配制或購買的試劑進(jìn)行質(zhì)檢,，保證試劑的性能穩(wěn)定可控,，均一。
3,、試劑使用注意事項：
試劑使用前必須混勻,。
4、移液器操作注意事項：
使用結(jié)束后調(diào)整至大量程,，取樣時槍頭深入頁面的深度盡量一直保持在1-2mm之間,，避免外壁沾過多試劑隨加樣進(jìn)入導(dǎo)致重復(fù)性不好。
5,、反應(yīng)液配制及注意事項：
加樣使用合適量程的移液器,；對于較小體積的移液，取液時候,，不可深入液體太多以免試劑沾到吸頭外壁至移液量不準(zhǔn)確,，深入1-2mm即可（尤其是粘稠試劑，如酶,，甘油等）,；
小體積試劑加樣務(wù)必：取液后眼觀是否取到液體，加樣務(wù)必浸入混合液一下吹吸數(shù)次,，棄吸頭前眼觀確定吸頭中無殘留,。
6、反應(yīng)液分裝及注意事項：
反應(yīng)液分裝前必須混勻（比如渦旋震蕩或移液器吹吸混勻）再分裝,；反應(yīng)液第一個孔分裝必須潤一下槍頭,，96孔之間加樣間隔時間盡量保持一致,，96孔的點樣位置盡量保持在96孔的相同位置，復(fù)孔之間盡量相鄰點樣,，點樣按照一定的順序,，吸取時槍頭深入頁面的深度盡量一直保持在1-2mm之間；
加樣使用移液器鑲緊移液器吸頭,，每次按至第一檔即可,，不可按至第二檔，避免氣泡產(chǎn)生和加樣不準(zhǔn)確（注：這個并不是使加樣準(zhǔn)確的方式,，只要保持所有孔的加樣方式相同,，可減少加樣誤差；）加樣盡量勻速,，不要加樣到孔外面,，以免對后面封膜造成影響。