分光光度計的用途解析
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率zui高的功能,?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈,、雙鏈DNA,，以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長260nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù),。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA,，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。測試前，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積,，爾后測試空白液和樣品液。然而,，實驗并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者zui頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。
事實上，分光光度計的設(shè)計原理和工作原理,，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度。如EppendorfBiophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）,。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動,，都是正常的。另外,，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測試時,，離子濃度太高，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定,、離子濃度較低的緩沖液，如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù),。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測試效果,。為了zui大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A,，吸光值在0.1-1.,。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小,，結(jié)果穩(wěn)定,。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）,。zui后是操作因素,，如混合要充分，否則吸光值太低,，甚至出現(xiàn)負(fù)值,；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物,，否則讀數(shù)漂移劇烈,；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大,；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的zui小體積等多個操作事項,。
除了核酸濃度,，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值,，用于評估樣品的純度,，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品,，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響,。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物,，多肽，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子,。純樣品,，A320一般是0。
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸,，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì),。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）
這種方法是在280nm波長,，直接測試蛋白,。選擇Warburg公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度,，或者是選擇相應(yīng)的換算方法,，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單,，先測試空白液,，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),，一般要消除320nm的“背景”信息,，設(shè)定此功能“開”。與測試核酸類似,，要求A280的吸光值至少大于0.1A,，*的線性范圍在1.0-1.5之間。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時,，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”,。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上,，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%,，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg公式吸光值換算成濃度,，乘以一定的系數(shù),，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大,，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定,。蛋白質(zhì)直接定量方法,，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì),。紫外直接定量法相對于比色法來說,，速度快，操作簡單,；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,，如DNA的干擾；另外敏感度低,，要求蛋白的濃度較高,。
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