氟苯尼考

快速檢測(cè)試劑盒說明書

一,、原理

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氟苯尼考將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗氟苯尼考抗體,，加入酶標(biāo)記物后,，用TMB底物顯色,，樣本吸光值與其所含殘留物氟苯尼考的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物氟苯尼考的含量,。

二,、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：   0.1ppb
• 孵育溫度：       25℃
• 孵育時(shí)間：       30min～15min
• 樣本檢測(cè)下限

蜂 蜜                                                              0.1ppb

組 織                                                              5 ppb

牛 奶                                                              0.2ppb

• 交叉反應(yīng)率

氟苯尼考                                                        100%

甲砜霉素                                                          < 0.1%

氟苯尼考胺                                                      11%

氯霉素                                                              < 0.1%

• 樣本回收率

組 織、蜂 蜜,、牛 奶                         90%±30%

三,、試劑盒組成

四,、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀,、均質(zhì)器、振蕩器,、離心機(jī),、刻度移液管,、天平（感量0.01g）,、氮吹儀,、恒溫箱

微量移液器：?jiǎn)蔚?20～200µl、單道100～1000µl,、多道 30～300 µl

試      劑：乙酸乙酯,、正己烷、乙腈

五,、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔,，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

• 樣本前處理需配制：

配液1  樣本提取液：

將20X濃縮提取液用去離子水按1：19稀釋,。(1份20X濃縮提取液+19份去離子水),。

配液2  牛奶樣本提取液：

將乙腈與乙酸乙酯按 1:2 比例混合均勻（1份乙腈+2 份乙酸乙酯）。

• 樣本處理：

（a）組織 (雞肉/肝,、豬肉/肝,、蝦、魚等)樣本處理方法

• 稱取均質(zhì)后的樣本1±0.05g于50ml離心管中,，先加入10ml樣本提取液（配液1）,，振蕩2min,，室溫4000r/min以上離心5min；
• 取出100µl上層液體加入400µl樣本提取液（配液1）,，混合均勻,；
• 取50 µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  50倍

注：如需檢測(cè)范圍包含100ppb,，可在上述步驟1離心后取出100µl上層液體加入900µl樣本提取液（配液1）,，混合均勻；取50µl用于分析,。

此時(shí),，樣本稀釋倍數(shù)為：100倍

（b）蜂蜜處理方法

• 取2±0.05 g蜂蜜，放入離心管中,，用4ml去離子水溶解,；加入4ml乙酸乙酯振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min,；
• 移取2ml上層清澈液到另一離心管中,，50-60℃氮?dú)饬飨赂稍铮挥?ml樣本提取液（配液1）溶解干燥的殘留物,，混合30s；
• 取50 µl用于分析,。

樣本稀釋倍數(shù)：  1倍  

（c）牛奶樣本處理方法

• 吸取牛奶樣本1ml于5ml離心管中,， 加 入2ml

牛奶樣本提取液（配液2）振蕩1min，室溫  

4000r/min以上離心10min,；

2,、 取出1ml上層液體在50-60℃氮?dú)饬髦写蹈桑?

3、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物,，再加1ml

樣本提取液（配液1）混合30s,，室溫4000r/min

以上離心5min；去除上層有機(jī)相,；

4,、 取50 µl下層相用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  2倍      

六,、 酶標(biāo)免疫分析程序:

• 測(cè)定前應(yīng)須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）,。
• 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
• 在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的*性,，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。
• 所有恒溫孵育過程,，避免光線照射,，用蓋板膜蓋住微孔板,。

• 操作步驟：

• 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上,，注意每種液體試劑使用前均須搖勻,。
• 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋,，保存于2-8℃,。
• 配液：將15ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液,。
• 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置,。
• 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50µl/孔到各自的微孔中,，加入酶標(biāo)記物50µl/孔，然后再加入抗體工作液50µl/孔,，用蓋板膜封板,，25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
• 將孔內(nèi)液體甩干,，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次,，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。
• 顯色：加入底物A液50µl/孔,，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻,，25℃環(huán)境中避光顯色15min,。
• 測(cè)定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻,，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè),，5min內(nèi)讀數(shù)），測(cè)定每孔OD值,。

七,、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法,，定量判定用第2種方法,。注意樣本吸光度值與其所含氟苯尼考量成負(fù)相關(guān)。

1,、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml),。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0,，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243,； 0.1ppb為1.816,；0.2ppb為1.415；0.4ppb為0.74,；0.8ppb為0.313,；1.6ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.8ppb～1.6ppb,；樣本2的濃度范圍是0.2ppb～0.4ppb,，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氟苯尼考實(shí)際濃度。

2,、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算,，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%,，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),，以氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氟苯尼考實(shí)際濃度,。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析,。

八,、 注意事項(xiàng)

• 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
• 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會(huì)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作,。
• 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。
• 反應(yīng)終止液為2M硫酸,，避免接觸皮膚。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒,；稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度,、OD值變化；不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑,。
• 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封,；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下,。
• 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應(yīng)當(dāng)棄之,。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí)，表示試劑可能變質(zhì),。
• 該試劑盒*反應(yīng)溫度為25℃,，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
• 組織樣本若檢測(cè)結(jié)果高于80ppb,，可將樣本進(jìn)行再次稀釋后檢測(cè),，結(jié)果乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可。

九,、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期

• 儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存,，不要冷凍。
• 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年,，生產(chǎn)日期見包裝盒,。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效,，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，請(qǐng)放心使用。

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