貨號：YJ1172                                                   規(guī)格：100管/96樣

線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒說明書

微量法

正式測定前務(wù)必取 2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)胞色素C氧化酶,，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分,，負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞色素C的氧化,，并終把電子傳遞給氧,，生成水。

測定原理：

還原型細(xì)胞色素C在550nm有特征光吸收,，線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞色素C生成氧化型細(xì)胞色素C,，因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、臺式離心機(jī),、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板,、研缽、冰和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體 100mL×1 瓶,，-20℃保存；

試劑二：液體 20mL×1 瓶,，-20℃保存,；

試劑三：液體 1.5mL×1 瓶，-20℃保存,；

試劑四：液體 20mL×1 瓶,，4℃保存；

試劑五：粉劑×1 支,，-20℃保存,；

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存,；

樣本的前處理：

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,，加入1mL試劑一和10uL試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿 600g,，4℃離心 5min,。

3、棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11100g，4℃離心 10min,。

4,、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅳ（此步可選做）,。

5,、步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三,，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W，超聲3s,，間隔10秒,，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅳ酶活性測定,。

測定步驟：

1,、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至550nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解,，置于37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）孵育5min,；用不完的試劑 4℃可保存一周,；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和200μL工作液,，混勻，立即記錄550nm處初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2,，計(jì)算 ΔA=A1-A2,。

注意點(diǎn)： 若 ΔA 大于0.2，需將樣本用試劑二稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）,，使 A1-A2 小于 0.2,，可提高檢測靈敏度。

復(fù)合體Ⅳ活力單位的計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位,。復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位。復(fù)合體Ⅳ活力 (nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d ）×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=222×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位,。復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.444×ΔAV 反總：反應(yīng)體系總體積,，2.1×10 ^-4 L,；ε：細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴ L/ mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V 樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL,；T：反應(yīng)時間,，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬。

b.使用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位,。復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=2198×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位。復(fù)合體Ⅳ活力 (nmol/min/g 鮮重 )=[ΔA×V反總÷（ε×d ）×10⁹]÷(W×V樣 ÷V樣總)÷T=444×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位,。復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.888×ΔAV 反總：反應(yīng)體系總體積,，2.1×10 ^-4 L；ε：細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù),，1.91×10⁴ L/mol/cm,；d：96 孔板光徑，0.5cm,；V 樣：加入樣本體積,，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積,，0.202mL,；T：反應(yīng)時間，1 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。

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