酶標醋酸纖維膜免疫電泳技術(shù)

• 酶標醋酸纖維膜免疫電泳技術(shù)的原理

由于醋酸纖維膜是由醋酸纖維素組成的,，對蛋白質(zhì)分子的移動幾乎無阻力，差不多所有在電場中能泳動的物質(zhì)均能在醋酸纖維膜里自由移動，因此在免疫電泳中,，醋酸纖維膜是一優(yōu)良的載體,。將酶標記抗體與相應(yīng)抗原在醋酸纖維膜進行電泳，生成免疫復合物,，用酶底物顯色,，能大幅度地提高檢測的靈敏度和可靠性。使用酶標醋酸纖維膜免疫電泳技術(shù)（Enzyme-Linked-Cellulosa-Acetate-membrane-Immunoelectropheresis,簡稱ELCAIE）,，筆者文章公布的檢出量是0.3ng的RMV,，其實當時的實驗結(jié)果已經(jīng)顯示0.1ng的RMV檢測量。

二,，的程序（檢測RMV）

1,器材與設(shè)備

（1）電泳儀（包括電泳槽）,；

（2）醋酸纖維膜（10cm×14cm,厚度10dmm；

（3）微量進樣器,；

（4）竹鉗,。

2，材料與試劑

（1）       以0.2mol/LpH7.2硼酸緩沖液連續(xù)稀釋的RMV溶液（10ng/ml→1×10⒌ng/ml）,；

（2）       HRP標記的RMV免疫的兔IgG(戊二醛一步法交聯(lián)),；

（3）       洗滌液，每1000ml中有500ml 0.1mol pH8.2巴比妥緩沖液和85g食鹽,，其余為蒸餾水,；

（4）       底物與供氫體溶液（H2O2和DAB－4HC1）；

（5）       0.1mol/L pH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液,。

 3,，實驗程序

（1）       將醋酸纖維膜用軟鉛筆輕輕劃好點樣線，酶標抗體樣點距膜邊3cm,抗原樣點與酶標抗體樣點對距3cm,兩個樣點橫距1.5cm.

（2）       將上述薄膜浸入0.1mol/L pH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液中浸濕,，取出薄膜,，用濾紙吸去表面水分，但不要干燥,。

（3）       用微量進樣器點樣,，抗體每樣點用酶標抗體液10ul,抗原樣點*點是對照，滴加10ul健青菜蛋白溶液,；第二,、三、四,、五樣點滴加RMV抗原溶液各10ul,濃度分別為1×10⒌ng/ml,、1×10⒋ng/ml、1×10⒊ng/ml,、100ng/ml,；第六,、七樣點分別滴加5ul、3ul,、，濃度為100ng/ml,；第八樣點滴加10ul,濃度為10ng/ml,；第九樣點滴加5ul,濃度為10ng/ml.

（4）       點樣完畢，將薄膜置于電泳槽中央棱邊,，使其架空,，然后用濾紙作鹽橋，電泳緩沖液為0.1mol/L PH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液,，抗原端接負極,。

（5）       待作為鹽橋的濾紙全部濕潤后，接通電源,，控制電壓150V,，電泳時間1.5h左右。

（6）       電泳完畢,，將薄膜浸洗在洗滌中過一夜,。

（7）       次日將薄膜在清水中漂洗3－5min后取出。

（8）       zui后滴加H2O2（0.3%）和DAB－4HC1溶液,，各占一半量,，幾分鐘內(nèi)就會顯示結(jié)果。（進入公司展臺）