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199次大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6)
細(xì)胞介紹
膠質(zhì)細(xì)胞株C6是由Benda等用N-nitrosomethylurea誘導(dǎo)的大鼠膠質(zhì)瘤克隆,并經(jīng)過(guò)一系列的體外培養(yǎng)和動(dòng)物傳代交替后建成的,。當(dāng)細(xì)胞從低密度生長(zhǎng)到滿瓶時(shí),,S-100產(chǎn)量增加10倍。
細(xì)胞特性
1) 來(lái)源:大鼠,,膠質(zhì)瘤
2) 形態(tài):成纖維細(xì)胞,,貼壁生長(zhǎng)
3) 含量:>1x106
4) 污染:支原體、細(xì)菌,、酵母和真菌檢測(cè)為陰性
5) 規(guī)格:T25瓶或者1mL凍存管包裝
運(yùn)輸和保存:可選擇干冰運(yùn)輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細(xì)胞方式:(1)干冰運(yùn)輸,,收到后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復(fù)蘇;(2)存活細(xì)胞,,收到后應(yīng)繼續(xù)生長(zhǎng),,傳代達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),再進(jìn)行凍存。具體操作見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)步驟,。
細(xì)胞用途:僅供科研使用,。
細(xì)胞接收后的處理:
1) 收到細(xì)胞后,請(qǐng)檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況,,若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損,、有液溢出及細(xì)胞有污染,請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們,。
2) 在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí),,hao在低倍鏡(4或5X物鏡)下進(jìn)行,能準(zhǔn)確判斷細(xì)胞的傳代密度,??醇?xì)胞的形態(tài)請(qǐng)?jiān)?0X和20×物鏡下,同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照,,(10×,,20×)各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,作為細(xì)胞需要售后時(shí)提供收到細(xì)胞時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù),。
3) 觀察好細(xì)胞狀態(tài)后,,75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h。
4) 貼壁細(xì)胞:在運(yùn)輸過(guò)程中貼壁細(xì)胞會(huì)有脫落的現(xiàn)象,,如發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞有脫落或者脫落后抱團(tuán)生長(zhǎng),,可將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞1000rpm離心5分鐘,,棄去上清重懸后接種到加有按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基的原培養(yǎng)瓶中(或新的培養(yǎng)瓶中),。
5) 懸浮細(xì)胞:T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和細(xì)胞1000rpm離心5分鐘,,棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中(加入按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基),。
6)備注:運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞,請(qǐng)換用按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞,。 收到細(xì)胞后第yi次傳代建議1:2傳代 ,。
細(xì)胞培養(yǎng)步驟
一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備:
1) 準(zhǔn)備F12K(推薦iCell-0007)培養(yǎng)基;馬血清,,15%,;優(yōu)質(zhì)胎牛血清,2.5%,;雙抗,,1%。注:?jiǎn)我谎迮囵B(yǎng)細(xì)胞的不能保證細(xì)胞狀態(tài),。
2) 培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,,95%,;二氧化碳,5%,。 溫度:37攝氏度,,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3) 凍存液:90%血清,,10%DMSO,,現(xiàn)用現(xiàn)配。
二. 細(xì)胞處理:
1) 復(fù)蘇細(xì)胞:將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,,加入4mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜(或將細(xì)胞懸液加入10cm皿中,加入約8ml培養(yǎng)基,,培養(yǎng)過(guò)夜),。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2) 細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。
對(duì)于貼壁細(xì)胞,傳代可參考以下方法:
1. 棄去培養(yǎng)上清,,用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次,。
2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,,迅速拿回操作臺(tái),輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。
3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,,輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心4分鐘,,棄去上清液,,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 收到細(xì)胞后*傳代推薦將細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,,建議凍存一支備用,,后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2到1:5的比例進(jìn)行。
3)細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),,可進(jìn)行細(xì)胞凍存,。貼壁細(xì)胞凍存時(shí),,棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶,細(xì)胞變圓脫落后,,加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中,,再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。
下面T25瓶為類,;
1,細(xì)胞凍存時(shí),,棄去培養(yǎng)基后,,PBS清洗一遍后加入1ml胰酶,細(xì)胞變圓脫落后,,加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化,,可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2,,4min 1000rpm 離心去掉上清,。加1ml血清重懸細(xì)胞,,根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO,,輕輕混勻,DMSO終濃度為10%,,細(xì)胞密度不低于1x10E6/ml,,每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液,注意凍存管做好標(biāo)識(shí),。
3,將凍存管置于程序降溫盒中,,放入-80度冰箱,,至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取,。
注意事項(xiàng):
1. 收到細(xì)胞后,若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈,、凍存管瓶蓋脫落,、破損及細(xì)胞有污染,請(qǐng)立即與我們聯(lián)系,。
2. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性,必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作,,并請(qǐng)注意防護(hù),,所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。
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