呋喃西林代謝物快速檢測試劑盒說明書

一,、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA 方法,，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物呋喃西林代謝物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃西林代謝物抗體,，加入酶標(biāo)記物后,，用 TMB 底物顯色， 樣本吸光值與其所含殘留物呋喃西林代謝物的含量成負(fù)相關(guān),，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物呋喃西林代謝物的含量。
二,、試劑盒特性
?試劑盒靈敏度：    0.02ppb
?孵育溫度：    25℃
?孵育時間：    30min~15min
?樣本檢測下限
組  織    ·······································   0.1ppb
雞  蛋    ·······································   0.1ppb
?交叉反應(yīng)率
呋喃西林代謝物    100%
呋喃唑酮代謝物    ＜0.1%
呋喃妥因代謝物    ＜0.1%

5    底物A 液    7ml    白色帽
6    底物B 液    7ml    黑色帽
7    終止液    7ml    黃色帽
8    20X 濃縮洗滌液    40ml    白色帽
9    2X 濃縮復(fù)溶液    50ml    透明帽
10    衍生化試劑    10ml    黑色帽

四,、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標(biāo)儀,、均質(zhì)器,、振蕩器、離心機,、刻度移液管,、天平（感量 0.01g）、氮吹儀,、恒溫箱,、恒溫水浴鍋
微量移液器：單道 20~200µl、單道 100~1000µl,、多道 30~300 µl
試    劑：氫氧化鈉,、K2HPO4·3H2O、正己烷,、乙酸乙酯,、濃 HCl
五、樣本前處理步驟
?樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭,，吸取不同試劑時要更換吸頭,。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈， 必要時可對實驗器具進行清潔,，以避免污染干擾實驗結(jié)果,。
?樣本前處理需配制
配液 1 0.1M K HPO 溶液：

2、 在 70℃水浴鍋中孵育 20min,；
3,、 分別加入 5ml 0.1M K2HPO4 溶液,，0.4ml 1M NaOH 溶液和 6ml 乙酸乙酯，充分振蕩 30s,；
4,、 在室溫下（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min
（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足   3ml        ，在80      ℃  水浴孵育樣品10min      并重復(fù)離心,；或提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復(fù)離心）,；
5、 取出 3ml 的乙酸乙酯到另一個容器中于 50℃氮氣/空氣吹干,。
6,、 用 2ml 正己烷溶解干燥物，再加入 1ml 樣本復(fù)溶液充分混合 30s,；在室溫下 4000r/min 以上離心    10min,；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min,，       重復(fù)離心）,；
7、 取 50µl 下層用于分析,。
樣本稀釋倍數(shù): 2 倍
此方法與呋喃唑酮代謝物,、呋喃它酮代謝物、         呋喃妥因代謝物,、氯霉素試劑盒可合一處理,。
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
?測定前應(yīng)須知：
1,、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫
（20～25℃）,。
2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃,。
3,、 在ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性,，正確的洗板操作是 ELISA 測定

個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行,，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5,、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品 50µl/孔到各自的微孔中,，加入酶標(biāo)記物 50µl/孔，然后再加入抗體工作液 50µl/ 孔,，用蓋板膜封板,，25℃環(huán)境中反應(yīng) 30min。
6,、 將孔內(nèi)液體甩干,，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次,，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。
7,、 顯色：加入底物A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔,，輕輕振蕩混勻,，25℃環(huán)境中避光顯色 15min。
8,、 測定：加入終止液 50µl/孔,，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測,，5min 內(nèi)讀數(shù)）,，測定每孔 OD 值。
七,、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法,，粗略判定可用第 1 種方
法，定量判定用第 2 種方法,。注意樣本吸光度值與其所含呋喃西林代謝物量成負(fù)相關(guān),。
1,、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml),。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3， 樣本 2 的吸光度值為 1.0,，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是： 0ppb 為 2.243,；0.02ppb 為 1.816；0.06ppb 為 1.415,；
0.18ppb 為 0.74,；0.54ppb 為 0.313；1.62ppb 為 0.155,。

2    4    程序中的要點,。

則樣本 1 的濃度范圍是 0.54ppb～1.62ppb；樣本 2

呋喃它酮代謝物    ＜0.1%
?樣本回收率
組  織    95%±25%
雞  蛋    95%±25%
三,、試劑盒組成

稱 11.4g K2HPO4·3H2O 加去離子水溶解定溶至 500ml,。
配液 2 1M HCl 溶液：
取 8.6ml 濃HCl 加去離子水定容至 100ml。配液 3 1M NaOH 溶液：
稱 4g NaOH 加去離子水定容至 100ml
配液 4 樣本復(fù)溶液：
將 2X 濃縮復(fù)溶液用去離子水按 1：1 稀釋,。
?樣本處理

4,、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射,，用蓋板膜蓋住微孔板,。
?操作步驟：
1,、 從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～
25℃）平衡 30min 以上,，注意每種液體試劑使用前均須搖勻,。
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔,，將不用的微孔放入自封袋,，保存于 2-8℃。

的濃度范圍是 0.06ppb～0.18ppb,，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃西林代謝物實際濃度,。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算,，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以di一個標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值,，再乘以 100%，即
B

肌肉組織,、雞蛋樣本處理方法

3,、 配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去
離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份

百分吸光率（%）＝

×100%
B0

1、 稱取 1±0.05g 的均質(zhì)物,，分別加入 4ml 的蒸餾
水,，0.5ml 1M HCl 溶液和 100µl 衍生化試劑， 充分振蕩 2min,；

去離子水）,，或按所需用量配制洗滌液。
4,、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,，每

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0—0ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以呋喃西林代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中， 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃西林代謝物實際濃度,。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確,、快速分析,。（歡迎來索取）
八,、 注意事項
1,、 室溫低于 25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～
25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作,。
3,、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。
4,、 反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚,。
5,、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度,、OD 值變化,；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6,、 不用的微孔板放進自封袋重新密封,；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下,。
7,、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之,。標(biāo)準(zhǔn)品 1 的吸光度值小于 0.5 時,，表示試劑可能變質(zhì)。
8,、 該試劑盒*反應(yīng)溫度為 25℃,，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。
九,、儲藏條件和保質(zhì)期
1、 儲藏條件：試劑盒于 2～8℃保存,，不要冷凍,。
2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年,，生產(chǎn)日期見包裝盒,。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效,，不影響實驗結(jié)果,，請放心使用。

   氨芐青霉素檢測試劑盒