復(fù)合體Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又稱NADH-CoQ 還原酶或NADH脫氫酶,，廣泛存在于動(dòng)物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,，是線粒體內(nèi)膜中大的蛋白復(fù)合物。該酶催化一對(duì)電子從NADH 傳遞給CoQ,，同時(shí)可使O2還原生成O2.-,，是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生O2.-的主要部位。測(cè)定該酶活性,，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈（ETC）狀態(tài),，而且可以反映活性氧（ROS）生成狀態(tài)。

測(cè)定原理

復(fù)合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成 NAD+,，在340nm下測(cè)定NADH的氧化速率計(jì)算出該酶活性的大小,。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī),、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板,、研缽,、冰和蒸餾水,。

試劑的組成和配制

試劑一：液體 100mL×1 瓶，-20℃保存,；試劑二：液體 20mL×1 瓶,，-20℃保存；試劑三：液體 1.5mL×1 瓶,，-20℃保存,；試劑四：液體 25mL×1 瓶，-20℃保存,；試劑五：液體 1mL×1 支,，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1 支,，-20℃保存,，用時(shí)加入2mL蒸餾水，現(xiàn)配現(xiàn)用,。工作液的配制：臨用前將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解,；現(xiàn)配現(xiàn)用；

樣本的前處理：

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞,，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

② 將勻漿600g,，4℃離心 5min。

③ 棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11000g，4℃離心10min,。

④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅰ（此步可選做）,。

⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,，加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W,，超聲3s，間隔10秒,，重復(fù)30次）,，用于復(fù)合體Ⅰ酶活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1,、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、樣本測(cè)定

（1）工作液于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min,。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL工作液和15μL試劑六,，混勻,，記

錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和2min 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2,。

復(fù)合體Ⅰ活力單位的計(jì)算

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T

=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W×V樣÷V樣總)

÷T=365×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷

T=0.73×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V 樣總：加入提取液體積,，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間,，2 min,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬(wàn)。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T

=3616×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)

÷T=730×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)

÷T=1.46×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2.25×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×103L/mol/cm,；d： 96孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL,； T：反應(yīng)時(shí)間,，2 min；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn),。

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