游離脂肪酸(FFA)含量測(cè)定試劑盒說明書

微量法

FFA 既是脂肪水解的產(chǎn)物,又是脂肪合成的底物。血清中 FFA 的濃度與脂類代謝,、糖代謝,、內(nèi)分泌功能有關(guān)。

測(cè)定原理：

FFA 與銅離子結(jié)合形成脂肪酸銅鹽,，并溶于lv仿,；利用銅試劑法測(cè)定銅離子含量，即可推算出游離脂肪酸含量,。

自備儀器和用品：

研缽、冰,、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液槍、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96 孔板,、一個(gè) 25 mL 玻璃瓶、兩個(gè) 10 mL 玻璃瓶,、正庚烷,、無水甲醇,、lv仿（三氯甲烷）、無水乙醇和蒸餾水,。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶,，室溫保存。

試劑二：自備,。實(shí)驗(yàn)前1 d,，加入9.6 mL正庚烷，0.4 mL無水甲醇,，10 mL lv仿（自備）,， 蓋緊后混勻，室溫保存,。

試劑三：液體×1 瓶,，室溫保存。

試劑四：粉劑×1 瓶,，4℃保存,。臨用前在試劑瓶中加入4 mL無水乙醇，充分溶解,。

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1 瓶,，室溫保存。臨用前加入7.8 mL LV仿充分溶解,，即為500µmol/L 的棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,。

樣品中 FFA提取：

1,、血液中 FFA 測(cè)定：將所取血液,，室溫靜置 1 h 后，于 4 ℃ 離心機(jī) 3 500 rpm 離心 15min,， 取上層血清置于-20℃冰箱保存,，待測(cè)。

2,、組織中 FFA 含量測(cè)定：組織用生理鹽水沖洗干凈后,，用吸水紙吸取表面水分，按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，入 1mL 試劑一） 進(jìn)行冰浴勻漿,，8000rpm，4℃離心 10min,，取上清液,，待測(cè)。

3、細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體（mL）為500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一）冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w,，超聲 2 秒，間隔 3秒,，總時(shí)間 3min）,；然后 8000rpm，4℃,，離心 10min,，取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定：

• 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 以上,，調(diào)節(jié)波長到 550 nm,，蒸餾水調(diào)零。
• 空白管：取0.5mL EP管,，加入 2µL 蒸餾水,，100µL 試劑二，40µL 試劑三,，

蓋緊后充分震蕩混勻（2min）,，靜置5 min，取上層清液50µL于0.5mLEP管,，加入100µL 試劑二,，40µL 試劑四，混勻后倒入微量石英比色皿/96 孔板,，靜置 15min,，于 550nm 光吸收，記為 A 空白管,。

• 標(biāo)準(zhǔn)管：取 0.5mL EP管,，加入 2µL 標(biāo)準(zhǔn)液，100µL 試劑二,，40µL 試劑三,，

蓋緊后充分震蕩混勻（2min），靜置5 min,，取上層清液50µL于0.5mLEP管,，加入100µL 試

劑二，40µL 試劑四,，混勻后倒入微量石英比色皿/96 孔板,，靜置 15min，于 550nm 光吸收,，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管,。

• 測(cè)定管：取 0.5mL EP 管，加入2µL上清液,，100µL 試劑二,，40µL 試劑三，

蓋緊后充分震蕩混勻（2min）,，靜置5 min,，取上層清液50µL于0.5mLEP管，加入100µL 試劑二,，40µL 試劑四,，混勻后倒入微量石英比色皿/96 孔板，靜置 15min,，于 550nm 光吸收,，記為 A 測(cè)定管。

FFA 含量計(jì)算：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1. 血液中 FFA 含量計(jì)算

FFA（µ mol/L）=[C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×1 L

=500×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) C 標(biāo)準(zhǔn)液：500µmol/L,；1 L：指每升樣品,。

2. 組織中 FFA 含量計(jì)算

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

FFA（µ mol/mg prot）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)] ÷Cpr

=0.5×(A測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算

FFA（µ mol/g mass）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×V樣總÷W

=0.5×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷W

3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

FFA（µ mol/104cell）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×V 樣總

÷細(xì)胞數(shù)量=0.5×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C 標(biāo)準(zhǔn)液：500µmol/L；1 L：指每升樣品,；V 樣總：上清液總體積,，1 mL=0.001L；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣品質(zhì)量，g,。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1. 血液中 FFA 含量計(jì)算

FFA（µ mol/L）=[C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×1 L

=500×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) C 標(biāo)準(zhǔn)液：500µmol/L,；1 L：指每升樣品。

2. 組織中 FFA 含量計(jì)算

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

FFA（µ mol/mg prot）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]÷Cpr

=0.5×(A測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算

FFA（µ mol/g mass）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×V樣總÷W

=0.5×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷W

3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

FFA（µ mol/104cell）=[C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×V 樣總÷細(xì)胞數(shù)量=0.5×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C 標(biāo)準(zhǔn)液：500µmol/L,；1 L：指每升樣品,；V 樣總：上清液總體積，1 mL=0.001L,；Cpr：樣

本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣品質(zhì)量,，g,。

注意事項(xiàng)：

1. 試劑四配制應(yīng)盡量晚配，在操作到加入試劑三時(shí),，再配制試劑四,。

2. 該試劑盒不可用塑料比色皿和 96 孔板測(cè)定，需用玻璃比色皿,。

青霉素-鏈霉素混合溶液（100×雙抗）