葡萄糖含量試劑盒說明書

微量法

正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

葡萄糖不僅是細(xì)胞能量代謝的主要底物,，而且其代謝中間產(chǎn)物是生物合成的重要底物,。植物可通過光合作用產(chǎn)生葡萄糖。就哺乳動(dòng)物而言,，葡萄糖不僅是大腦神經(jīng)系統(tǒng),、肌肉、脂肪組

織等的唯YI能源,，而且與還原性輔酶,、乳糖和乳脂的合成密切相關(guān)。

測定原理：

葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸,，并產(chǎn)生過氧化氫,；過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚,，生成有色化合物，在 505 nm 有特征吸收峰,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板,、研缽和蒸餾水

試劑的組成和配制：

試劑一：0.5μmol/mL 葡萄糖溶液 10mL×1 瓶，4℃保存,；

試劑二：液體 10ml×1 瓶,，4℃保存；

試劑三：液體 10ml×1 瓶,，4℃保存,；

葡萄糖提取：

1,、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL蒸餾水），研磨成勻漿,，冰浴,，功率20％或200W，超聲3S,，間隔10S,，重復(fù)30次后，8000g,，25℃離心10min,，取上清液備用。

2,、細(xì)菌或細(xì)胞處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：蒸餾水體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL蒸餾水）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率20％或200W，超聲3S,，間隔10S,，重復(fù)30次），95℃水浴10分鐘（蓋緊,，防止水分散失）,，冷卻后，8000g,，25℃離心 10min,，取上清液備用,。

3、其他類液體,，離心后可直接取上清檢測。

測定步驟：

1,、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至505nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、混合試劑的配制：使用前將試劑二和試劑三1:1等體積混合，用多少配多少,。

3,、加樣表（在EP管或96孔板中加入下列試劑）：

混勻，置 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25'C（其它物種）保溫 15min 后,，于 505nm 波長處讀取吸光

度,。空白管,、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管吸光值分別記為 A1,、A2 和 A3?？瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)管只要做一管,。

葡萄糖含量計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

葡萄糖含量(µmol/mg prot)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr)

=0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷Cpr,。

2,、按樣本鮮重計(jì)算

葡萄糖含量（µmol/g 鮮重）= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)

=0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

葡萄糖含量（µmol/10⁴cell)= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(500×V1÷V2)

=0.001×(A3-A1)÷(A2-A1)

C 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度,，0.5µmol/mL,；V1：加入樣本體積，0.1mL,；V2：加入提取液體積,，1mL；

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本鮮重，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500 萬。

注意：低檢測限為 50nmol/g  鮮重或 0.5nmol/mg prot

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