硝基咪唑類酶聯(lián)免疫試劑盒說明書

一、藥物概述及檢測原理

硝基咪唑類抗菌藥,，主要用于治療和預(yù)防滴蟲,、阿米巴原蟲及厭氧菌引起的感染。但由于本類藥物有致癌作用,，很多國家禁止其用于畜,、禽、水產(chǎn)等產(chǎn)品的養(yǎng)殖,。我國規(guī)定禁止本類藥物作為動物的促生長劑,。

本公司的硝基咪唑類酶聯(lián)免疫試劑盒使用zui新生物技術(shù)開發(fā)，具有方便,、快速,、靈敏等特點。

本試劑盒利用硝基咪唑類抗體與硝基咪唑類可產(chǎn)生特異性結(jié)合的性質(zhì),，先在酶標(biāo)板上預(yù)包被抗原,，再加入標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）和硝基咪唑類抗體，樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的硝基咪唑類藥物與固定在酶標(biāo)板上的抗原競爭硝基咪唑類抗體,，再加入酶標(biāo)記二抗反應(yīng),，后加入底物催化顯色,。此時顯色深度與標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）中硝基咪唑類藥物的含量成反比,。

二、試劑盒內(nèi)包含組分：

標(biāo)準(zhǔn)品工作液：0 ppb,、0.1 ppb,、0.3 ppb,、0.9 ppb、2.7 ppb,、8.1 ppb,，1 mL/瓶。

96孔酶標(biāo)板：1塊

硝基咪唑類抗體工作液：1瓶（6mL/瓶）

酶標(biāo)Ⅱ抗工作液：1瓶（12 mL/瓶）

20×濃縮洗滌液：1瓶（30 mL/瓶）

組織樣品處理液Ⅰ：1瓶（干粉,，選配,，如有需求請向廠家索取)

牛奶樣本處理液：1瓶（10ml/瓶,，選配,，如有需求請向廠家索取）

復(fù)溶工作液：1瓶（50 mL/瓶）

底物A液：1瓶（6 mL/瓶）

底物B液：1瓶（6 mL/瓶）

終止液：1瓶（6mL）

說明書

蓋板膜

自封袋

三,、用戶需要自備的設(shè)備和試劑

儀器：

酶標(biāo)儀（檢測波長450 nm,、630 nm）

電子天平（精度：0.01 g）

離心機（3000 g及以上）

生化培養(yǎng)箱（可調(diào)4℃,，25℃）

搖床

旋渦振蕩器

氮吹儀

微量移液器：（20μl-200μl,、100μl-1000μl各一支,、30-300ul八道排槍）

計時器

試劑：（試劑均為分析純）

乙酸乙酯

正己烷

氫氧化鈉

濃鹽酸

四,、試劑盒特異性

試劑盒與其他硝基咪唑類藥物的交叉反應(yīng)率：

v 甲硝唑…………………………………100%

v 羥基甲硝唑……………………………47%

v 羥甲基甲硝咪唑………………………53%

v 替硝唑…………………………………2%

v 地美硝唑………………………………800%

v 奧硝唑…………………………………5%

五,、樣本檢測步驟

1. 1工作液準(zhǔn)備

v 組織樣品處理液Ⅰ：將粉末藥品溶于200ml去離子水即得（如有需求請向廠家索?。?/span>

v 組織樣品處理液Ⅱ：準(zhǔn)確量取400 mL乙酸乙酯和100 mL正己烷,，充分混勻后待用,。

v 洗滌工作液：取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。

v 0.1M NaOH：稱取0.8 g NaOH,，加入200 mL去離子水溶解,。

v 1M HCL：量取1ml濃鹽酸，加入11mL去離子水溶解混勻,。

2. 2樣品前處理

組織（雞肉,、豬肉）（稀釋倍數(shù)：0.5）

Ø 精確稱取2 g均質(zhì)后的組織樣品于50 mL塑料離心管中；

Ø 加入2 mL組織樣品處理液Ⅰ（見5.1）,，強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）以使處理液Ⅰ與樣本充分接觸,；

Ø 加入8 mL組織樣品處理液Ⅱ（見5.1），充分震搖（或渦動）3 min（注：若實驗室配置有搖床,，可充分震搖1min后使用搖床300rpm 25℃震搖10分鐘）,；

Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 取4 mL上清液于潔凈的玻璃離心管中,；

Ø 使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑,；

Ø 加入2 mL正己烷，再加入0.5 mL復(fù)溶工作液,，強烈震搖1min（或渦動30 s）,；

Ø 使用離心機室溫3000 g以上，離心5 min；

Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機相吸除器可使操作更加安全,、方便,、快捷）；

Ø 取50 μL下層液體進行分析,。

蜂蜜（稀釋倍數(shù)：0.5）

Ø 稱取2.0±0.05g蜂蜜樣本至50ml塑料離心管中,；

Ø 加入2ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見5.1），強烈震搖使蜂蜜溶解,；

Ø 加入4ml 乙酸乙酯,強烈震搖5min（或使用渦動儀渦動3min）使樣本與有機相充分接觸,；

Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 移取2ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相),，使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑,；

Ø 加入0.5 mL復(fù)溶工作液，強烈震搖2min（或渦動1min）,；

Ø 取50 μL下層液體進行分析,。

原奶方法一（稀釋倍數(shù)：5）

Ø 將采樣好的原奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上；

Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層,，小心取出1ml樣本加入2ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）,；

Ø 加入50μL 1M鹽酸（見5.1），強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）,；

v 使用離心機室溫4000 g以上離心10 min,；

Ø 取上層清亮液體100μL加入另一干凈離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油），再加入400μL復(fù)溶工作液,，強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）,；

Ø 取50 μL液體進行分析。

原奶方法二（稀釋倍數(shù)：1）

Ø 將采樣好的原奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上,；

Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層,，小心取出2ml樣本加入50ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；

Ø 加入100μL 牛奶樣本處理液,，再加入6ml乙酸乙酯,，強烈震搖5min （或使用渦動儀渦動1min）；

Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min,；

Ø 取1.5 mL上清液于潔凈的玻璃離心管中,；

Ø 使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；

Ø 加入1 mL正己烷,，再加入0.5 mL復(fù)溶工作液,，強烈震搖1min（或渦動30 s）；

Ø 使用離心機室溫3000 g以上,，離心5 min,；

Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機相吸除器可使操作更加安全,、方便、快捷）,；

Ø 取50 μL下層液體進行分析,。

生蛋方法一（稀釋倍數(shù)：1）

Ø 量取1ml全蛋樣本至50ml塑料離心管中,；

Ø 依次加入1ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見5.1），8ml 乙酸乙酯,強烈震搖5min（或使用渦動儀渦動3min）使樣本與有機相充分接觸,；

Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min,；

Ø 移取4ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相)，使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑,；

Ø 加入0.5 mL復(fù)溶工作液,，1ml正己烷,，強烈震搖2min（或渦動1min），離心機室溫3000 g以上離心5 min,；

Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機相吸除器可使操作更加安全、方便,、快捷）,；

Ø 取50 μL下層液體進行分析。

生蛋方法二（稀釋倍數(shù)：5）

Ø 取出1ml樣本加入2ml離心管中,；

Ø 加入100μL 1M鹽酸（見5.1）,，強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；

Ø 使用離心機室溫4000 g以上離心10 min,；

Ø 取上層清亮液體100μL加入另一干凈離心管中,，再加入400μL復(fù)溶工作液，強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）,；

Ø 取50 μL液體進行分析,。

熟蛋（稀釋倍數(shù)：2）

Ø 稱取1g熟蛋樣本至50ml塑料離心管中；

Ø 依次加入1ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見5.1）,，8ml 乙酸乙酯,強烈震搖5min（或使用渦動儀渦動3min）使樣本與有機相充分接觸,；

Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min,；

Ø 移取2ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相),，使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑,；

Ø 加入0.5 mL復(fù)溶工作液，1ml正己烷,，強烈震搖2min（或渦動1min）,，離心機室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機相吸除器可使操作更加安全,、方便,、快捷）；

Ø 取50 μL下層液體進行分析,。

3. 3檢測

準(zhǔn)備：將要使用的酶標(biāo)板條插入酶標(biāo)板架上,，并記錄各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，為減小檢測值波動建議做雙孔平行實驗（每個樣本/標(biāo)準(zhǔn)品點兩孔）,，未使用的酶標(biāo)板條用自封袋密封后,，保存于2-8℃環(huán)境中以防變質(zhì)；

加樣：向?qū)?yīng)微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣品溶液50 μL,，再向每孔中加入50 μL抗體工作液,；

孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后,，蓋好蓋板膜于4℃避光反應(yīng)60 min,；

洗滌：取出酶標(biāo)板后小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體后,，在每孔加 250 μL洗滌工作液,，浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液，然后再加入洗滌工作液重復(fù)洗滌3~4次后,，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上,，用力拍干；

加酶：在每孔中加入100 μL酶標(biāo)Ⅱ抗工作液（洗滌后的酶標(biāo)板在加酶前不宜在室溫環(huán)境過長時間放置,，以防微孔干燥導(dǎo)致實驗結(jié)果差異）,；

孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)20min,；

洗滌：按照前面敘述的方法再次洗滌酶標(biāo)板,；

顯色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合,，混合液在10 min內(nèi)使用,，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質(zhì)失效）,；

孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s,，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)15 min,；

終止：在反應(yīng)后的微孔中加入終止液50μL/孔,，底物液由藍變黃表明終止成功,。

讀數(shù)：終止后的酶標(biāo)板應(yīng)在5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀數(shù)，建議使用450 nm,、630 nm雙波長讀取酶標(biāo)板吸光度值,。

4計算結(jié)果

設(shè)各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）的吸光度平均值為B，零標(biāo)準(zhǔn)（濃度為0 ppb的標(biāo)準(zhǔn)品）吸光度平均值B₀以(B/B₀)×100%為各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）對應(yīng)的吸光度的百分比：

使用半對數(shù)系統(tǒng)代入標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的吸光度的百分比,，與標(biāo)準(zhǔn)品濃度擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，即可得出樣品對應(yīng)的濃度,，后乘以樣品相應(yīng)的稀釋倍數(shù),，即可得出樣品中檢測物含量,。

六,、試劑盒參數(shù)

Ø 試劑盒靈敏度：0.1 ppb；

Ø 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：0.1 ppb-8.1 ppb,；

Ø 板內(nèi)變異系數(shù)：<5%,；

Ø 板間變異系數(shù)：<15%；

Ø B0吸光度ZUI佳值：>0.8,；

Ø 回收率：90%±30%

Ø 樣品低檢測限：

豬肉,、雞肉…………………………………………約0.5 ppb

蜂蜜…………………………………………………約0.1 ppb

原奶方法一…………………………………………約1 ppb

原奶方法二…………………………………………約0.2ppb

生蛋方法一…………………………………………約0.5 ppb

生蛋方法二…………………………………………約1.5 ppb

熟蛋……………………………………v……………約1 ppb

注：ppb=ng/mL或ng/g。

七,、分析限制

本試劑盒為定量或半定量試劑盒,，建議用于大量樣本篩查分析。若檢測結(jié)果為陽性,，建議使用儀器方法開展確證實驗（如GC/MS,、LC-MS/MS等）。

八,、試劑盒貯存條件及有效期

Ø 試劑盒貯存在2-8℃有效期為一年,，切勿凍存。

Ø 未使用完的酶標(biāo)板條須密封保存2-8℃的環(huán)境中,。

九,、注意事項

Ø 使用試劑盒前，請務(wù)必仔細閱讀說明書,。

Ø 試劑盒使用前,，需將盒內(nèi)各組份置于實驗臺上回溫至室溫（25±2℃）（提示：約1 h）。

Ø 試劑在使用前許搖勻,，混合時應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡,。

Ø 槍頭為一次性用品，為防止試劑交叉污染,，檢測過程中所用槍頭不得重復(fù)使用,。

Ø 請勿使用過期試劑盒,，不同批號試劑盒中的試劑不得混用。

Ø 樣品處理完畢后請立即分析,，否則可能影響檢測結(jié)果,。

Ø 底物A液、底物B液均為無色透明液體,，若在使用前已變成藍色,，或混合后立即變藍，說明試劑已污染或變質(zhì),。

Ø 加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速,，以免反應(yīng)時間差對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

Ø 終止液中含有硫酸,，若不小心濺上皮膚或衣物請立即用大量清水沖洗,。若不慎ru眼，請在*清洗后去醫(yī)院檢查,。

食品安全檢測試劑