聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ELISA法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是分子生物學(xué)技術(shù)中檢測DNAzui靈敏的方法之一,，而酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是免疫學(xué)中zui敏感和特異的檢測方法的代表,。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ELISA法（PCR-ELISA）集上述兩方法之精髓，成為繼PCR之后又一個(gè)靈敏性更高,、特異性更強(qiáng),、省時(shí)易行的新方法[7]。根據(jù)生物素和地谷新標(biāo)記底物的不同,，PCR-ELISA主要分為兩大類：*類為用生物素和地谷新同時(shí)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記,；第二類則是分別對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和核酸雜交探針進(jìn)行標(biāo)記。

生物素和地谷新同時(shí)標(biāo)記PCR產(chǎn)物主要有三種途徑：①在PCR反應(yīng)混合物中同時(shí)加入生物素和地谷新標(biāo)記的脫氧核苷酸類似物（DIG-Bio-dUTP）;②加入生物素化的引物和DIG-dUTP;③加入生物素化引物1和地谷新標(biāo)記的引物2,。實(shí)驗(yàn)方法如下：將標(biāo)記的PCR產(chǎn)物用乙醇沉淀,，或用純化柱除去未結(jié)合的標(biāo)記物，加至親合素包被的酶標(biāo)板孔中孵育1~2h,，*洗滌,，加抗地谷新抗體，然后加入堿性磷酸酶結(jié)合物底物孵育,，終止反應(yīng)后,，根據(jù)吸光度（A）值判斷結(jié)果。這類親合素介導(dǎo)的固相捕獲生物素標(biāo)記的靶分子檢測系統(tǒng),，靈敏度高于PCR檢測,，且操作簡便、快速,，重復(fù)應(yīng)用性好,，可以在短時(shí)間內(nèi)（<4h）準(zhǔn)確檢測大量的臨床標(biāo)本（血清、分泌液或甲醛固定標(biāo)本）,；通過適當(dāng)調(diào)整PCR循環(huán)次數(shù)及相關(guān)參數(shù)并對(duì)多時(shí)間點(diǎn)上產(chǎn)量進(jìn)行線性分析,，可對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。由于檢測系統(tǒng)是建立在雙標(biāo)記核酸片段上的,，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)非特異性PCR產(chǎn)物吸附,，引起本底偏高的現(xiàn)象。

第二類PCR-ELISA為生物素和地谷新分別標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和核苷酸探針,。用生物素化的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，然后加入親和素包被的酶標(biāo)板中，冰浴1h,，經(jīng)洗滌后加入變性劑（50mmol/L NaOH）室溫作用數(shù)分鐘,，加入雜交液和地谷新標(biāo)記的探針,，雜交完成經(jīng)洗滌后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地谷新抗體，室溫下作用1h經(jīng)充分洗滌后加顯色劑,，讀取A值,。該方法利用生物素化引物獲得含生物素的PCR產(chǎn)物，使產(chǎn)物能與包被在酶標(biāo)板上的親和素牢固地結(jié)合,，使特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物吸附于酶標(biāo)板上,，繼而用地谷新標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交和放大，這一方法特異性強(qiáng),，靈敏度高,，重復(fù)性好。

PCR-ELISA方法的*性主要表現(xiàn)在以下四個(gè)方面,。①利用生物素-親和素系統(tǒng)的強(qiáng)大親和能力,，其親和常數(shù)K約為抗原抗體的104~107倍，為A蛋白（SPA）對(duì)IgF,。的108倍,。生物素和親和素二者高度特異的快速結(jié)合，不易受外界干擾,，復(fù)合物十分穩(wěn)定,，極少發(fā)生離解，提高了實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性,，縮短了反應(yīng)時(shí)間,。此外，親和素不含糖基,，等電點(diǎn)為pH=6.0,，與其他抗原或抗體包被酶標(biāo)板比較，其非特異性吸附顯著減少,，靈敏度得到提高,。②PCR擴(kuò)增使陽性信號(hào)通過擴(kuò)增本身以及地谷新抗原抗體反應(yīng)得到極大程度的放大，從而使檢測的靈敏度進(jìn)一步提高,。③PCR-ELISA中尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)移酶的使用,，使PCR技術(shù)中交叉污染得以極大程度的控制而不影響檢測效果，基本克服了PCR雜交技術(shù)中由于污染造成的假陽性問題,。④標(biāo)記探針的使用,，使檢測的特異性進(jìn)一步提高，可以與放射性標(biāo)記的Southern雜交相媲美,，且探針的引進(jìn)使其應(yīng)用的范圍增大,，比PCR本身在基因多態(tài)性分析、病毒分型、克隆鑒定等方面顯示了其*的優(yōu)勢(shì),。另外，非同位素標(biāo)記系統(tǒng)的應(yīng)用又避免了使用同位素帶來的危害,，而且整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期較Southern雜交明顯縮短（約 6h）,，并且操作簡便，可用于大批量標(biāo)本的同時(shí)檢測,。當(dāng)然PCR-ELISA方法的建立有一定的要求,，其中PCR產(chǎn)物和探針的雜交條件（PCR產(chǎn)物的稀釋度、雜交溫度和時(shí)間）與檢測敏感性,、特異性有密切關(guān)系,。