小鼠白三烯B4（LTB4）ELISA試劑盒說(shuō)明書

本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測(cè)定小鼠血清,，血漿及相關(guān)液體樣本中白三烯 B4（LTB4）含量。提供免費(fèi)代檢測(cè)服務(wù),。
實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中小鼠白三烯 B4（LTB4）水平,。用純化的小鼠白
三烯 B4（LTB4）抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入白三烯 B4
（LTB4）,，再與 HRP 標(biāo)記的白三烯 B4（LTB4）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，
經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物 TMB 顯色,。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下
轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的白三烯 B4（LTB4）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在 450nm
波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠白三烯 B4（LTB4）濃度。
試劑盒組成：
試劑盒組成 48 孔配置 96孔配置 保存
說(shuō)明書 1份 1份
封板膜 2 片（48） 2片（96）
密封袋 1個(gè) 1個(gè)
酶標(biāo)包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品：225ng/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存
酶標(biāo)試劑 3ml×1 瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
樣品稀釋液 3ml×1 瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
顯色劑 A 液 3ml×1 瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
顯色劑 B 液 3ml×1 瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
終止液 3ml×1 瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
20倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶 30ml×1 瓶 2-8℃保存
樣本處理及要求：
1.血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘,，離心 20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上
清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。
2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA、者檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,，混合 10-20 分鐘后，
離心20 分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再
次離心,。
3.尿液：用無(wú)菌管收集,，離心 20 分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中
如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行,。
4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集,。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/
分）,。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃
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度達(dá)到 100 萬(wàn)/ml 左右。通過(guò)反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心 20 分鐘
左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。
5.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱取重量,。加入一定量的 PBS，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br />用,。標(biāo)本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將
標(biāo)本勻漿充分,。離心 20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè),，
其余冷凍備用,。
操作步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10孔，在*,、第二孔中分別加標(biāo)
準(zhǔn)品 100μl,，然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,，混勻,；然后從*孔、第二
孔中各取 100μl 分別加到第三孔和第四孔,，再在第三,、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl，
混勻,；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 棄掉,，再各取 50μl 分別加到第五、第六孔
中,，再在第五,、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50ul，混勻,；混勻后從第五,、第六孔中各
取 50μl 分別加到第七、第八孔中,，再在第七,、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl，混
勻后從第七,、第八孔中分別取 50μl 加到第九,、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)
品稀釋液 50μl,，混勻后從第九第十孔中各取 50μl 棄掉,。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl，
濃度分別為 150ng/L,，100ng/L ,，50ng/L，25ng/L,， 12.5ng/L）,。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）、待測(cè)樣
品孔,。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl,，然后再加待測(cè)樣品 10μl（樣
品zui終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混
勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30分鐘,。
4. 配液：將 20倍濃縮洗滌液用蒸餾水 20 倍稀釋后備用,。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去,，如此
重復(fù) 5 次，拍干,。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl,，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3,。
8. 洗滌：操作同 5,。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色
15分鐘.
10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。
11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零,，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止
液后 15分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。
注意事項(xiàng)：
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開封后如未
用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。
2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果,。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差,。一次加樣時(shí)間
控制在 5 分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。
4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本 OD 值
大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD 值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定,，計(jì)
算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。
6．底物請(qǐng)避光保存,。
7．嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
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8．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。
9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
10. 如與英文說(shuō)明書有異,，以英文說(shuō)明書為準(zhǔn),。
計(jì)算：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo),，
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的 OD
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋
倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計(jì)算出標(biāo)
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的 OD 值
代入方程式，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋
倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R 值為 0.990以上,。
2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于 9%和 11%
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：,；2-8℃。
2．有效期：6 個(gè)月