ELISA應(yīng)用的一些說(shuō)明：克服非特異性吸附

在ELISA中,，非特異性吸附是值得注意的問(wèn)題，如果抗原或抗體純化不過(guò)關(guān),，產(chǎn)生非特異性吸附是實(shí)驗(yàn)操作中無(wú)法避免的,。

但是，即使抗原抗體的純化達(dá)到一定水平,，還是有可能產(chǎn)生非特異性吸附,。例如塑料載體表面的吸附，為了避免非特異性顯色,，需用含Tween20的PBS或生理鹽水作為洗脫液,，吐溫 （Tween）就是指聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì),，常作為助溶劑,。根據(jù)它與聚合山梨醇所結(jié)合的脂肪酸種類不同而進(jìn)行吐溫編號(hào)，結(jié)合月桂酸的為吐溫20,，結(jié)合棕櫚酸的為溫40,，結(jié)合硬脂酸的為吐溫60,，結(jié)合油酸的為吐溫80。在免疫酶技術(shù)中常用含吐溫20的PBS作洗滌劑或作稀釋樣品和酶標(biāo)抗體（抗原）之用,，它的洗滌效果要比牛血清蛋白溶液（0.5%）好,，具有減少非特異性吸附和增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合的作用。吐溫20的使用量一般在0.06%-0.1%.有學(xué)者認(rèn)為,，Tween20還有增強(qiáng)特異性反應(yīng)的作用,。另外，檢測(cè)血清和酶標(biāo)記抗體用含0.5%-1%牛血清白蛋白（或0.1%白明膠）稀釋也能得到增強(qiáng)特異性吸附的作用,。樣品首先用稀釋的健血清孵育,，也有助于去除非特異性顯色。除此之外,，反應(yīng)的時(shí)間和掌握反應(yīng)劑zui適濃度,，也有助于克服非特異性吸附。反應(yīng)一般需4~5h（25℃）,，如要減少反應(yīng)時(shí)間則可升至37℃,，雖然反應(yīng)溫度為37℃時(shí)對(duì)靈敏性和準(zhǔn)確性稍有影響，但是減少了保溫時(shí)間（需2~3h）,，對(duì)結(jié)果影響并不大,，因此，37℃被經(jīng)常采用,。酶標(biāo)記抗體的濃度太高,，易出現(xiàn)假陽(yáng)性；太低,，則不靈敏,。所用待測(cè)樣品、酶標(biāo)記抗體和抗抗體的zui適濃度,，通過(guò)實(shí)驗(yàn)才能獲得,。在一定范圍內(nèi)，ELISA的反應(yīng)強(qiáng)度與待測(cè)樣品濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系,，通過(guò)一系列不同稀釋度的待測(cè)樣品的測(cè)定,，才能得出待測(cè)樣品的zui適稀釋度范圍。另外,，由于加入固相載體進(jìn)行致敏的抗原量過(guò)多,，因而造成的前帶（prozone）效應(yīng)，也可以通過(guò)測(cè)試抗血清的稀釋度而消除,，因?yàn)樵诳贵wzui適量的情況下,，多余的抗原也不起干擾作用。關(guān)于酶標(biāo)記抗體的zui適濃度,，可以通過(guò)劑量反應(yīng)曲線（一系列稀釋的陽(yáng)性和陰性血清,，與同一濃度的酶標(biāo)記抗體反應(yīng)）,，選擇同一稀釋度的陽(yáng)性和陰性血清分別對(duì)不同稀釋度的酶標(biāo)記抗體反應(yīng)而確定。陽(yáng)性血清的吸收值與陰性血清的吸收值之比為zui大值時(shí),，酶標(biāo)記抗體的濃度為zui適濃度,。