可能影響酶免疫測定ELISA結果的標本內源性干擾因素

1.類風濕因子（rheumatoid factors,RF）在類風濕患者,、其他疾病以及正常人血清中,常含有較高或不同濃度的RF，RF一般為TgM型,，亦有IgG和IgA型,，RF具有與變性IgG產生非特異結合的特點，因為在ELISA測定中,，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標的特異抗體IgG結合,，從而出現假陽性結果。尤其是在捕獲法IgM型特異抗體的測定中表現zui為明顯,，因為此時固相包被的抗體為抗人弘鏈抗體,，IgM型RF的存在可使其大量結合于固相。為避免RF對ELISA測定的干擾,，通?？梢圆扇∠率龃胧?/span>

（1）稀釋標本：這在判斷急性病原體感染的特異IgM抗體如抗HAVIgM，抗HBclgM,， TORCH的IgM抗體檢驗等尤為有用,。因為急性感染時，血循環(huán)中特異的IgM抗體滴度通常很高,，而RF滴度通常相對要低得多,。因此,，在測定前對標本進行稀釋，特異的IgM因高滴度存在仍可檢出,，而非特異的RF則會因為稀釋變成非常低的滴度,，從而對測定幾乎不產生干擾。現在,，有些特異IgM檢測ELISA試劑盒不要求稀釋標本,，直接檢測，這樣雖然方便了實驗室技術人員的操作,，但容易出現假陽性結果，并且由于某些慢性感染,，如HBV的感染,，血循環(huán)中抗HBelgM可持續(xù)以一定的滴度存在，標本不做稀釋即進行檢測,，即可出現陽性結果,，從而失去抗HBclgM用于HBV急性感染的診斷價值。因此,，在臨床實驗室,，一定要使用要求對標本做1:1000稀釋的試劑盒進行檢驗，從而保證相應檢測項目結果的可靠性及臨床應用價值,。

（2）改變酶標抗體：由于RF結合的是IgG的Fc片段,，如果將待酶標的抗體的F，片段酶切夫除,，僅留下具有特異結合功能的F（ab’）2部分標記酶,，則在測定中即可避免RF的干擾。

（3）標本中RF用變性IgG預先封閉：將經熱變性（63℃,，10min）的動物如兔,、羊等的IgG加入到標本稀釋液中，或是將該變性IgG連接至一顆粒固相如聚苯乙烯微球或微孔,，然后加入臨床血清標本,，反應后，再吸出標本進行檢測,。此外,，在測定特異IgM時，也可使用抗人IgG去除臨床標本中RF和IgG,。

（4）測定抗原時,，可在標本中加入可使RF降解的還原劑：如2—巰基乙醇。2—巰基乙醇等還原劑可使抗體內的巰基裂解,，因而可以去除RF的干擾,，但只適用于抗原測定,。

（5）包被或酶標二抗使用特異的雞抗體IgY：RF不與雞IgY反應，如果包被和酶標二抗均為雞IgY抗體,，則不受標本中RF的干擾,。

2.補體在固相酶免疫測定中，來自哺乳動物的固相特異抗體和酶標二抗均有激活人補體系統(tǒng)的功能,。一方面,，固相抗體和酶標二抗可因為其在固相吸附及結合過程中，抗體分子發(fā)生變構,，從而其F, 段的補體C1,，結合位點被暴露出來，這樣C1,，就成為一個中介物將二者交聯起來,，從而出現假陽性結果。另一方面,，固相抗體也會因為活化補體的結合,，封閉抗體的抗原表位結合能力，而引起假陽性結果或使定量測定結果偏低,。由補體引起的干擾可通過下述方法避免：

（1）對臨床血清標本加熱滅活補體：采用56~C30min加熱可使標本中的補體C1,。滅活。

（2）包被或酶標二抗使用特異的雞抗體：雞抗體不激活人的補體系統(tǒng),，因此,，使用特異的雞抗體，不會出現因補體激活而存在的假陽性和假陰性干擾,。

3.異嗜性抗體（heterophilieantibodies）人類血清中含有抗嚙齒類動物（如鼠,、馬、羊等）的免疫球蛋白（lg）的抗體,，即天然的異嗜性抗體,。有研究表明，天然的異嗜性抗體（lgG）可分為兩類,，一類（85%的假陽性由其引起）可結合于山羊,、小鼠、大鼠,、馬和牛IgG的Fab區(qū)域,，但不與兔IgG的Fab區(qū)結合。另一類（15%的假陽性由其引起）可結合于小鼠,、馬,、牛和兔IgG的Fc區(qū)表位，但不與山羊和大鼠IgG的Pc區(qū)表位結合,。異嗜性抗體可通過交聯固相和酶標的單抗或多抗而出現假陽性反應,。由異嗜性抗體引起的干擾可通過下述方法避免：

（1）使用特異的兔F（ab’）2,。片段作為固相或測定酶標抗體。

（2）在標本或標本稀釋液中加入過量的動物Ig,，封閉可能存在的異嗜性抗體,。但加入量不足或亞類不同時無效。

（3）使用靶特異的非Ig親和蛋白（affibody）替代固相或酶標抗體之一,。采用噬菌展示來自單個金黃色葡萄球A蛋白（SPA）聯合文庫的人IgA結合親和蛋白,，用于IgA的測定，不受異嗜性抗體的影響,。

4.因使用鼠抗體治療或診斷誘導的抗鼠Ig抗體在臨床上,，有嘗試使用鼠源性單克隆抗體進行靶向治療，及使用放射性核索標記鼠源性單克隆抗體進行影像診斷等,，均有可能使相應患者體內產生抗鼠抗體,。這種抗鼠抗體對使用鼠源性單克隆抗體的酶免疫測定，可產生假陽性結果,。由抗鼠抗體引起的干擾可通過下述方法避免：

（1）使用的特異的抗體（F，,。bf）:片段作為固相或測定酶標抗體,。

（2）在標本或標本稀釋液中加入過量的鼠Ig，封閉可能存在的抗鼠抗體,。

（3）使用特異的雞抗體IgG作為固相和測定抗體,。雞IgG不與人抗鼠抗體反應。因而,，用其作為固相或酶標抗體不會出現假陽性結果,。

5.自身抗體   自身抗體如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島索等,，能與其相應靶抗原結果形成復合物,，在ELISA方法中可干擾相應原抗體的測定。為避免以上情況出現,，可在測定前用理化方法將其解離,。

6. 溶菌酶溶菌酶可與等電點較低的蛋白有強的結合能力。免疫球蛋白等電點約為5,，因此,，在雙抗體夾心法ELISA測定中，溶菌酶可在包被的IgG和酶標的IgG間形成橋接,，從而導致假陽性,。因此，為保證ELISA測定的可靠性,，有必要從標本中去除溶菌酶或將其封閉,，Cu2+離子和卵白蛋白可有效地封閉溶菌酶,，防止其連接IgG。

內源性干擾因素一般包括類風濕因子,、補體,、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體,、某些自身抗體,、因使用鼠抗體治療或診斷誘導的抗鼠Ig抗體、交叉反應物質等,。在日常的臨床血清（漿）標本中,，有相當比例不同程度的含有上述各種干擾物質，從而導致測定結果的假陽性,。