EF03B-J2b 

喹諾酮類

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

    試劑盒采用間接競爭ELISA方法,，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原,，樣本中的殘留物喹諾酮類藥物和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗喹諾酮類藥物抗體,，加入酶標記物后，用TMB底物顯色,，樣本吸光值與其所含殘留喹諾酮類藥物的含量成負相關,，與標準曲線比較即可得出相應殘留物喹諾酮類藥物的含量。

二,、試劑盒特性

1. 試劑盒靈敏度：      0.1ppb
2. 孵育溫度：          25℃
3. 孵育時間：          30min～15min
4. 樣本檢測下限

組織 ,、血清 ········································  1ppb

1. 交叉反應率

恩諾沙星（ENR）   ··························    100%

環(huán)丙沙星（CIF）   ····························    100%

氧氟沙星（OFL）    ··························    60%

奧索利酸（OXO）  ···························  116.86%

達氟沙星（DAN）  ···························  102.63%

諾氟沙星（NOR）  ···························  148.65%

洛美沙星（LOM）  ··························   86.24%

培氟沙星（PEF）   ··························  156.60%

依諾沙星（ENO）  ···························   98.97%

氟喹酸（FLU）    ···························   96.73%

麻保沙星（MAR）  ··························  110.63%

氨氟沙星（AMI）  ···························   98.86%

那氟沙星（NAD）  ···························   56.81%

1. 樣本回收率

組織、血清 ·································     85±20%

三,、試劑盒組成

四、所用儀器,、試劑

具備的儀器：微孔酶標儀,、打印機、均質(zhì)器 ,、振蕩器,、離心機、刻度移液管,、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道 20～200ul,、單道100～1000ul、多道 250 ul

五,、樣本前處理步驟

1. 樣本處理前須知

處理任何樣本時,，都必須注意：

•  實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭,。
•  實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果,。

1. 樣本前處理需配制：

配液1  樣本復溶液

將20X濃縮復溶液用去離子水按1：19（1份濃縮復溶液+19份去離子水）進行稀釋,。

1. 樣本處理：

a）組織樣本處理方法

1、稱1.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中,；

2,、加入10ml樣本復溶液，振蕩3min,，4000r/min以上,，15℃離心10min；

3,、取上清50µl液體用于分析,。

     樣本稀釋倍數(shù)：10

b）血清樣本處理方法

1. 取50µl澄清的血清，加入450µl 樣本復溶液混合,，混勻30S（如果血清樣本渾濁,，將樣本于10℃,，4000r/min以上離心10min，分離出血清或過濾血清,，直至得到澄清的樣本）,；
2. 取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  10倍 

六,、 酶標免疫分析程序:

1. 測定前應須知：

1. 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20-25℃）,。
2. 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3. 在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的一致性,，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4. 所有恒溫孵育過程,，避免光線照射,，用蓋板膜蓋住微孔板。

1. 操作步驟：

1. 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出,，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻,。
2. 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封,，保存于2-8℃,，不要冷凍。
3. 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水）,，或按所需用量配制洗滌液,。
4. 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品均需做2孔平行,，并記錄標準孔的樣本孔所在的位置。
5. 加標準品/樣本50µl /孔,，然后加酶標記物50μl/孔,，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻,，用蓋板膜蓋板,，25℃環(huán)境反應30min。
6. 用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次,，每次浸泡15-30秒,，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7. 顯色：每孔加入底物A液50µl再加入底物B液50µl,，輕輕振蕩混勻,，25℃環(huán)境避光顯色15min。
8. 測定：每孔加入終止液50µl,，輕輕振蕩混勻,，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測,，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）,。

七,、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法,，定量判定用第2種方法,。注意樣本吸光度值與其所含喹諾酮類藥物量成負相關。

1,、粗略判定：

    用樣本的平均吸光度值與標準品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml),。假設樣本1的吸光度值為0.238， 樣本2的吸光度值為0.946,，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.845,； 0.1ppb為1.542；0.3ppb為1.130,； 0.9ppb為0.635,；2.7ppb為0.326； 8.1ppb為0.156,。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb - 8.1ppb,；樣本2的濃度范圍是0.3ppb - 0.9ppb。乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物的實際濃度,。

2,、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以個標準（0標準）的吸光度值,，再乘以100%,，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以喹諾酮類標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標,，繪制標準曲線圖,。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度,，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物實際濃度,。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確,、快速分析,。

八、 注意事項

1. 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低,。
2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作,。
3. 混合要均勻,，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。
4. 反應終止液為2M硫酸,，避免接觸皮膚,。
5. 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度,、OD值變化,；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6. 不用的微孔板放進自封袋重新密封,；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,，因此要避免直接暴露在光線下。
7. 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應當棄之,。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì),。
8. 該試劑盒理想反應溫度為25℃,，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九,、儲藏條件和保質(zhì)期

1. 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存,，不要冷凍。
2. 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年,，生產(chǎn)日期見包裝盒,。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效,，不影響實驗結(jié)果,，請放心使用。

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