貨號(hào)：YJ1174                                     規(guī)格：100管/48樣

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP 酶活性測(cè)定說明書

微量法

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP 酶廣泛分布于植物,、動(dòng)物,、微生物和細(xì)胞中，可催化ATP水解生成ADP和無(wú)機(jī)磷,。

測(cè)定原理：

根據(jù)Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATP 酶分解ATP生成ADP及無(wú)機(jī)磷,，通過測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量來確定ATP酶活性高低。

需自備的儀器及用品:

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、水浴鍋,、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板,、研缽、冰和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶,，4℃保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶,，4℃保存,。

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存,；臨用前加入6mL蒸餾水充分混勻待用,；用不完的試劑 4℃保存一周；

試劑三：液體 2mL×1 瓶,，4℃保存,。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存,。用時(shí)加入3mL蒸餾水,， 4℃保存。

試劑五：粉劑×1 瓶, 4℃保存,。用時(shí)加入25mL蒸餾水,，溶解后 4℃保存一周。

試劑六：粉劑×1 瓶, 4℃保存,。用時(shí)加入25mL蒸餾水,，溶解后 4℃保存一周,。

試劑七：液體25mL×1 瓶，室溫保存,。

試劑八：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶,，4℃保存。

0.5μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑八20倍稀釋,，即取0.1mL試劑八加1.9mL蒸餾水充分混勻,。

定磷劑的配制：按 H₂O: 試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色,。若無(wú)色則試劑失效,，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配,。

注意：配試劑建議用新的燒杯,、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿,，避免磷污染,。

樣品酶液的制備：

1、細(xì)菌,、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率 20％或200W,，超聲3s,，間隔10s，重復(fù)30次）,；8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

操作步驟：

1,、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 660nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、酶促反應(yīng)（在 EP 管中加入下列試劑）

混勻，8000g,，25℃離心 10min,，取上清液

3、定磷（在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑）

混勻,，室溫放置30min,，在660nm處，記錄各管吸光值,。

注意事項(xiàng)：

1,、由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照，本試劑盒100管只能測(cè)48份 Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶,。

2,、此法具有微量、靈敏,、快速的特點(diǎn),。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格無(wú)磷。避免磷污染是

檢測(cè)成敗的關(guān)鍵,。

3,、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATPase 活力的計(jì)算：

1,、血清（漿）Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATPase 活力的計(jì)算:

定義：每小時(shí)每毫升血清（漿）中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶分解ATP產(chǎn)1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位,。

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP 酶活力（μmol/h/mL）= [C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷V 樣÷T=7.5×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）

2、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATPase 活力的計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算：

定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位,。

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶活力(μmol/h/mg prot)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷（V樣×Cpr）÷T =7.5×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

定義：每小時(shí)每克組織中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力

單位。

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(W× V樣÷V樣總)÷T=7.5×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

定義：每小時(shí)每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位,。

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶活力(μmol/h /10⁴cell)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.015×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度,，0.5μmol/mL；V 總：酶促反應(yīng)總體積,，0.25mL,；V 樣：加入樣本體

積，0.1mL ,；V 樣總：加入提取液體積,，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間,，1/6 小時(shí),；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本鮮重,，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn),。

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