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HTRF：均相時間分辨熒光技術(shù)介紹
【德國伯托微孔板分析儀：LB942和LB943提供HTRF檢測等多種吸收光,、發(fā)光、熒光類型檢測】
技術(shù)背景
HTRF®是均相時間分辨熒光技術(shù)的簡稱,，HTRF®技術(shù)是對TR-FRET技術(shù)的進一步改良,，提供了更高的靈敏度和穩(wěn)定性。如今,，HTRF®在藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域成為了受歡迎的方法之一,。
技術(shù)原理
HTRF®技術(shù)結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer） 和時間分辨熒光（TRF''Time Resolved Fluorescence)）兩種技術(shù),。該技術(shù)是利用了具有穴狀結(jié)構(gòu)的Eu元素的螯和標(biāo)記物和XL665作為一個供體（Donor）,，是基于Eu穴狀化合物的供體與受體（第二熒光標(biāo)記物）之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。在熒光共振能量轉(zhuǎn)移中,，受體發(fā)射熒光的壽命等同與供體的發(fā)射熒光的壽命,。因為Eu的熒光衰減周期較長，所以含Eu的供體會誘導(dǎo)XL665受體長時間地發(fā)射熒光,，受體激發(fā)后產(chǎn)生的熒光便能持續(xù)較長時間,，這樣通過時間分辨就可以區(qū)分那些短壽命的自身散射的熒光，這樣從短壽命熒光背景中就很容易區(qū)分出FRET信號,。
當(dāng)由于生物分子相互作用導(dǎo)致兩個熒光基團接近時,，在激發(fā)時被穴狀化合物捕獲的部分能量釋放，發(fā)射波長為620nm,；另一部分能量轉(zhuǎn)移到受體（acceptor）上,，發(fā)射波長為 665nm。665nm的發(fā)射光僅僅由供體（donor）引起的FRET產(chǎn)生。所以,，當(dāng)生物分子相互作用時,，有兩個激發(fā)光620nm和 665nm；當(dāng)不存在相互作用時,，只有620nm一個激發(fā)光,。
HTRF各字母所表示的含義
均相（Homogeneous）是指所有參與反應(yīng)的試劑或化合物無需經(jīng)過吸除處理,，反應(yīng)體系內(nèi)的各成分互不影響,。時間分辨熒光（TRF）即TR-FRET，時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移,。時間分辨（Time Resolved）指依靠時間來去除那些壽命較短的熒光,，從而分辨目標(biāo)熒光。F是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的意思,，指在供體和受體相互靠得很近時,，光子能從一個受激發(fā)的熒光團（供體）轉(zhuǎn)移到另一個熒光團（受體），并使后者發(fā)出熒光,。
技術(shù)特點
雖然 HTRF®也是基于TR-FRET的化學(xué)技術(shù),，但它的許多特點把它與其它TR-FRET產(chǎn)品區(qū)分開來。這些特點包括使用了鑭系元素（銪和鋱）,，從而具有非常長的半衰期,，很大的 Stroke's shift（如右圖所示，Eu3+Stroke's shift > 300 nm）,；同時,，鑭系元素與絡(luò)合的穴相結(jié)合，這種結(jié)合的穴狀物(Cryptate)與其它所有TR-FRET產(chǎn)品使用的螯合物結(jié)構(gòu)（Chelate）相比,，顯著增加了穩(wěn)定性(可耐受低pH值,、金屬離子、DMSO,、EDTA等）,；專門的比值測量能矯正淬滅和樣品帶來的干擾。
穴狀化合物的形成是將一個陽離子納入到一個立體籠中,?；\能收集光然后將能量轉(zhuǎn)移到核心的鑭系元素。大環(huán)的性質(zhì)有利于跟鑭系元素緊密相連,，這種不可破的連接會形成異常穩(wěn)固的復(fù)合體,。穴結(jié)構(gòu)能耐受一些特殊的實驗條件如大量存在的陽離子（Mg2+和 Mn2+等）、螯合物（EDTA）,、溶劑或者溫度,。從HTRF® 能應(yīng)用到臨床診斷就能看出它也適用于濃度高的血清（50%）。在讀板前或者孵育時加入氟離子能增強實驗對大量化合物的抗干擾性。穴沒有光漂白性,，多次讀數(shù)后信號沒有損失,，因此能按照需要的次數(shù)去讀，所以可以進行動力學(xué)檢測,。而螯合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性還未達到這個水平,。
總體而言，HTRF技術(shù)特點有：
a) 熒光持續(xù)時間更久
b) 時間選擇（時間延遲讀取測量）
c) 低背景
d) 校正干擾因素
e) 均質(zhì)式檢測
f) 能抵御金屬離子對信號的影響