徠卡倒置熒光顯微鏡

徠卡倒置熒光顯微鏡由于高分辨掃描電鏡的間世,，為用表面標(biāo)記技術(shù)觀察細(xì)胞表面形態(tài)和區(qū)別兩類紉胞群與其表面形態(tài)相的機能提供了條件,。用此技術(shù)方法可研究細(xì)胞表面抗原,、受體的性質(zhì),，分布及運動,。在原則上,，透射電鎊與熒光顯微鏡用的免疫標(biāo)記技術(shù)也適用于免疫掃描電子顯微術(shù),。但由于徠卡倒置熒光顯微鏡掃描電鏡與透射電鏡的成像原理不同,，因此對免疫掃描電境術(shù)的標(biāo)記物有些特殊要求。這些要求是：

1．清晰,、容易識別的形狀‘對透射電鏡的標(biāo)記物要求電子致密度高,，掃描電鏡的標(biāo)記物電子密度不是重要問題，而形狀是識別的重要因素,。

2．大小適宜：一般而言掃描電鏡分辨率低于透射電鏡,，此外掃描電鏡標(biāo)本要金屑鍍膜，這都影響樣品表面結(jié)構(gòu)的分辨,。因此標(biāo)記物若太小,、結(jié)構(gòu)過于微細(xì)，就不能與樣品表面固有結(jié)構(gòu)區(qū)別,，但標(biāo)記物過于大,，又不能明確定出去面抗原位置，因此標(biāo)記物大小要兼顧以上兩方面,。

3.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,，在標(biāo)本處理過程中不會被損壞品制備過程中能牢固地結(jié)合。

4.對細(xì)胞表面的固有親合力差,。

符合以上條件的較常用的表面標(biāo)記切有人工合成的非生物材料（膠乳顆粒,，硅酸聚合物等），生物大分子（鐵蛋白，血藍(lán)蛋白等）,，病毒（1MV）,，噬茵體和肢體金顆粒等。

徠卡倒置熒光顯微鏡膠乳顆粒有聚苯乙烯和丙烯兩種*聚苯乙烯類顆粒表面疏水,，易發(fā)生自聚集,。但與抗體以適當(dāng)比例混合時，不需偶聯(lián)便能很好地與抗體附著,。丙烯類顆粒表面有oH基,，自發(fā)聚集少。標(biāo)記時可利用oH基進行偶聯(lián),。

如果樣品以苯乙烯樹脂做為包埋劑,，徠卡倒置熒光顯微鏡再行割斷法做掃描電鏡觀察是十分方便的。因為苯乙烯聚合后,，氧化丙烯及醋酸異戊酌等很容易將其溶解,，多次更換溶劑便可將苯乙烯清除干凈。因此,，在制做透射電鏡標(biāo)本時,，多做出幾個包埋膠囊樣品，待聚合后,，按上述方法割斷,，將割斷好的樣品放在氧化丙烯中，約2小時后便可經(jīng)酷酸異戊酷置換,、臨界點干燥,。

除樹脂割斷法外，徠卡倒置熒光顯微鏡尚有有機溶劑（酒糟,、酷酸異戊圈等）割斷法,；水溶性包埋劑（二甲基亞礬、甘油等）割斷法及其它（冷凍,、氟里昂等）割斷法,，操作都很容易。再以酒精割斷法為例：樣品固定后用酒精脫水,，當(dāng)脫水完成后,，將樣品投入預(yù)先裝有無水乙醇的膠囊中（避免出現(xiàn)氣泡）。將膠囊放在低溫裝置內(nèi)使乙醇固化,。進行樣品割斷,。割斷的樣品立即進入置于室溫的無水乙醇中，待乙醇融化后移入醋酸異戊酷,、進行臨界點干保,。

徠卡倒置熒光顯微鏡硅酸聚合物顆粒為球形,。使用時先加入Y一氨基三乙氧基丙硅烷（Y咆加n04r出hoxypr叩山1ane）使顆贛表面帶一NH3，然后再與抗體偶聯(lián),。

TMv長300nmp寬16nm助長桿狀結(jié)構(gòu),。掃描電鏡下識別性好。能與18G牢固地結(jié)合,，形成TMv一[8G復(fù)合物,。如果紅細(xì)胞表面附有正常免[8G，TMv便能使這種紅細(xì)腦布滿桿狀物*由于該病毒過長使分辨率下降,，也有實驗室將其截短使用,。

常用的噬茵體是T4噬苗體（以大腸桿菌為宿主）有頭有尾，形如瞅助,。在徠卡倒置熒光顯微鏡掃描電鏡下識別性能好。但體積較大,，由x174也是以大腸桿菌為宿主的噬茵體,，呈二十面體。因為體積較小,，需用高倍觀察,。

如果徠卡倒置熒光顯微鏡應(yīng)用高分辨率掃描電鏡．金標(biāo)記是理想的。鐵蛋白雖然有高電子密度,，但分子畢竟大小,，因而應(yīng)用有限。

徠卡倒置熒光顯微鏡關(guān)于抗體的純化與透射電鏡所用的有關(guān)方法相同,，抗體與標(biāo)記物的偶聯(lián)也不在此贅述,。

備注：徠卡倒置熒光顯微鏡，部分文章由北京中儀光科科技發(fā)展有限公司,，編輯整理上傳,。