徠卡冰凍切片機復(fù)型膜的分離與撈取
徠卡冷凍超薄切片
徠卡冷凍超薄切片是把預(yù)先冷凍的樣品在冷凍條件下制備超薄切片的方法。冷凍超薄切片的目的是為了避免常規(guī)樣品制備過程個脫水、包埋等步驟,，因為這些步驟中的化學和物理因素常常導致細胞的變化,，如大分子的變性，抗原或酶活性的喪失,，可溶性成份的移位乃至流失,。
下面是徠卡冷凍超薄切片法的主要步驟。
一,、包裹
1,、在一聚乙烯塑料管中加入牛血清白蛋白，貼A溶于0.1ml的磷酸緩沖液中,，pH7．2,，濃度為10％一20％；
2,、符經(jīng)固定的組織塊表面的殘余液體月濾紙吸干,，L一面振動塑料管，一面向其中逐滴加入25％的戊二醛,，使管中戊二醛的zui終濃度為2．5％,；
L在上述條件下，徽約在半分鐘左右即可被戊二醛交連（聚合）,，用保險刀片將塑料管壁切除,。把聚合的脅切成小方塊，使其大小賂大于包埋于其中的組織塊,。如果樣品是游離細胞,，可按下進步驟包裹：
1、將帕A加入一離心管內(nèi),，濃度與上同,；
2、把經(jīng)過固定的細胞轉(zhuǎn)入離心管,；
3,、在冷凍離心機上離心10分鐘，800B,，40C,；
4、去掉上清,，在管底沉淀上加一滴用0．1m01／L磷酸緩沖液配制的10％的戊二醛,。
5,、用針把聚合后的團塊撥起，切成小塊,。
為防止冷凍時生成大的冰晶而使結(jié)構(gòu)破壞,，組織需經(jīng)冷凍保護劑處理，常用的冷凍保護劑有甘油和蔗糖,，均用緩沖液配制,，組織在冷凍保護劑中浸泡的時間為0.5—1J。
為防止大的冰品產(chǎn)生,，徠卡冰凍切片機除使用冷凍保護劑外,，應(yīng)采取速凍的辦法，其基本要求與具體作法和冷凍斷裂與蝕刻時相同,，即將經(jīng)冷凍保護的組織塊投入用液氮冷卻的氟里員12內(nèi),。
二、染色
經(jīng)過固定和甘油或DM肋保護的組織,，其冷凍超薄切片可以使用酷酸鈾和檸檬酸鉛染色,。如果冷凍保護劑使用的是蔗糖，上述染色將會使結(jié)構(gòu)嚴重破壞,。
對于徠卡冰凍切片機冷凍超薄切片,，zui常使用的染色方法是負染。這時,，可較正染法看到更多的結(jié)構(gòu)細節(jié),。負染的染液有鈞酸銨（2％，PH7．3）,，醋酸鈾（0.5％,，pH4．6）或酸性磷鎢酸（1％，pH6.7）染色時間為15—30秒,，室溫,。染后，用一濕的濾紙將多余染液吸
以上所述的徠卡冷凍超薄切片制備法適用于形態(tài),，細胞化學或免疫標記研究,。制備過程中樣品要通過一系列的水溶性介質(zhì)，可稱為濕法,。濕法會使樣品中的可溶性成份流失,，因此不能用于這些成份的研究。為研究紹胞中的可擴散的,，水溶性成份,，應(yīng)當使用于法制備超薄切片。下面是這一方法的要點。
1,、冷凍
將新鮮的未經(jīng)固定的樣品投入氮糊中,。氯糊的溫度為一2900c，可使液氯減壓蒸發(fā)而獲得,。也可將樣品壓到一個預(yù)冷到液氮溫度（-1960c）約銅塊上,，再和銅塊一起投入液氮中。
2,、切片
LJ片時,，樣品溫度為一1400C，刀的溫度為-100-C-1200c,，不用槽液,。切出的切片有干涉色。用睫毛筆將切片收集到載網(wǎng)上,。
3、展平
用一個預(yù)冷到液氮溫度的壓模將切片展平
4,、干燥
冷凍干燥
5,、保存
徠卡冰凍切片機冷凍干燥后的帶有切片的載網(wǎng)的氮氣，并用棉花塞蓋緊,。干切法得到的切片不能染色,。常規(guī)電鏡樣品制備過程中，為保存細胞結(jié)構(gòu),，樣品首先需要用化學固定劑固定,。即使在冷凍超薄切片法中，為穩(wěn)定切片,，樣品也需經(jīng)過固定,。而任何化學固定劑都可能使生物大分子變性，從而存在著破壞細胞細微結(jié)構(gòu)的潛在危險,。為避免這種可能,，是*不用化學方法而改用物理方法固定組織。冷凍置換就是這樣一種方法,。冷凍置換是將新鮮樣品冷凍固定后,，在低溫下用某種成份將樣品中的冰置換出來，再行包埋和切片的方法,。如呆說冷凍超薄切片法主要是避免了常規(guī)電鏡樣品制備中脫水和包埋這些步驟可能造成的人工假象,，
徠卡冰凍切片機的冷凍置換技術(shù)則是避免了化學固定的影響。
