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人外血淋巴細胞玻片制備程序詳解
閱讀：1185 發(fā)布時間：2016-1-12
(1)標本采集。用肝素潤濕的針筒采骨髓/外周血2-4ml,，培養(yǎng)按步驟(2)操作，不培養(yǎng)按步驟(3)操作,。（進行FISH實驗一般采用肝素抗凝）
(2)培養(yǎng)法：混勻后注入兩瓶含5ml培養(yǎng)液的標本瓶中,，每瓶0.3～0.5ml；每瓶中加入PHA0.2ml,，孵箱中培養(yǎng)24-72小時,，每日早晚各搖勻一次；阻斷中期分裂相,，與終止培養(yǎng)前2-4小時加入秋水仙素,，終濃度為0.1μg/ml。
(3)不培養(yǎng)：提取有核細胞（淋巴細胞分離液或去除紅細胞,，或按照常規(guī)方法）（如實驗不需要染色體分裂相,，可選用不培養(yǎng)法，步驟較簡單,；如果實驗需要在染色體分裂相上進行,，可選用培養(yǎng)法）
(4)收獲細胞。PBS洗,，1200rpm,，離心10分鐘。重復步驟（4）,。（在離心后,吸去上清液時,請注意上清中是否有油滴存在,如有,應盡量吸去油滴）
(5)低滲,。吸去上清液，加入6～8ml預熱至37℃的0.075mol/lKCl溶液,，吹打懸浮細胞,，37℃水浴溫育20分鐘,，期間吹打2－3次。（低滲液是指滲透壓和離子強度均低于正常細胞生理條件的溶液,，例如水,、低滲的檸檬酸鈉或氯化鈉、氯化鉀等,。低滲效果取決于低滲液的化學組成,、低滲的溫度和處理時間。低滲處理是憑借反滲透作用使細胞膨脹染色體鋪展,。該步驟的目的是使細胞盡量膨脹,，理想狀態(tài)是胞膜脹破得到裸露的細胞核）
(6)預固定。直接于細胞低滲混合液中緩慢加入2ml固定液,，混勻,。
(7)1200rpm，離心10分鐘,。
(8)固定,。去上清，加入6～8ml固定液,，混勻,。靜置10分鐘
(9)1200rpm，離心10分鐘,。
(10)重復步驟(8)和(9),。（細胞在低滲處理后處于較脆弱的狀態(tài)，固定的目的是讓細胞保持在這一狀態(tài)）
(11)細胞懸液的制備和保存,。去上清,，根據(jù)細胞量加適量固定液，制成濃度合適的細胞懸液,?；靹蚝蟮纹４思毎麘乙褐?20℃冰箱中可保存1個月,。在此期間可隨時取出,，離心去上清加入新鮮固定液，制片供FISH檢測之用,。（新鮮的標本容易得到好的雜交信號,，建議使用新鮮標本。）
（12）制片,。用吸管將細胞懸液輕輕吹打混勻后吸取少量,，滴至干凈的載玻片上，自然晾干,。剩余標本置于-20℃冰箱備用,。（根據(jù)明場顯微鏡下觀察確定合適的細胞密度）
（13）老化玻片,。室溫放置過夜或56℃烤片至少30分鐘。玻片放入玻片盒中,，室溫干燥保存,。建議不要將制好的片子放置太久，否則會影響信號的質(zhì)量,。通常情況下,，片子老化后馬上進行檢測。（玻片老化時間或溫度不足會導致實驗操作中出現(xiàn)嚴重細胞脫落現(xiàn)象）