反相色譜中的C18色譜柱是液相色譜中zui為常用的一類色譜柱,而C18色譜柱的選用主要依據(jù)柱填料和柱規(guī)格對(duì)色譜柱的影響,。
柱填料的物理性能對(duì)填料色譜行為有重要影響,，填料主要的物理性能包括如下：顆粒度、孔徑,、孔體積,、鍵合相化學(xué)、含碳量及烷基化處理,。
a. 顆粒度是指柱填料的顆粒直徑的大小,。實(shí)際上色譜柱上所標(biāo)的粒徑是一個(gè)平均值。如粒徑“5μm”并不是柱中填料所有的顆粒直徑都是5μm,，實(shí)際上有一個(gè)顆粒分布度,。這種分布度對(duì)柱反壓及柱效有重要作用。一般來說,，平均顆粒度越小,，顆粒分布度越小，色譜柱效越高,，反壓亦越高,。目前C18柱填料粒徑在4～10μm之間。
b. 孔徑是指填料顆粒間的孔間隙,。一般所說的孔徑是指填料的平均孔徑,。球形填料裝柱后平均孔徑分布比較窄，柱床結(jié)構(gòu)均勻,，柱效高,，重現(xiàn)性好；無定形填料平均孔徑分布較寬,，柱床結(jié)構(gòu)不均勻,，流動(dòng)相線性速度不均勻，譜帶擴(kuò)寬,。平均孔徑的大小對(duì)分離大分子化合物有較大的影響,，在分離含有較大分子的樣品時(shí)可能會(huì)有分子排阻效應(yīng)，或產(chǎn)生吸附效應(yīng)從而影響定量的回收率及準(zhǔn)確度,。因而在用反相色譜分離諸如蛋白或多肽樣品時(shí)應(yīng)考慮選用大孔徑(如30 nm)的反相柱填料,。孔體積作為硅膠多孔性的參數(shù),，在分離分析較大分子化合物時(shí)可作參考,，選用較大孔體積的反相柱填料。
c. 化學(xué)鍵合相填料在液相色譜法中占有極重要的地位,。它可以鍵合極性較大的有機(jī)基團(tuán),，采用極性較小的溶劑作流動(dòng)相。亦可鍵合極性較小的有機(jī)基團(tuán),，選用極性較大的溶劑作流動(dòng)相,。C18色譜柱是以硅烷化鍵合型(Si-O-Si-C)存在的，這類鍵合反應(yīng)目前應(yīng)用zui為普遍,。如以十八烷基三氯硅烷與全多孔型硅膠M-Porasil-C18反應(yīng)生成烷基化學(xué)鍵合相,，商品名為M-Bondapak-C18。
d. 碳含量即填料中的含碳量,。傳統(tǒng)的測(cè)量技術(shù)是將填料加熱到碳?xì)滏I斷裂,，然后通過測(cè)定損失的重量或形成的二氧化碳來計(jì)算碳含量,。可以通過增加碳鍵的長(zhǎng)度或增加鍵合密度來增加碳含量,。碳含量增加,，柱子的保留值增加。鍵合相的色譜行為與鍵合密度有關(guān),，也與硅膠的密度及填料的表面積有關(guān),，填料的密度越高，填柱所需的硅膠量越多,，柱子的含碳量也越高,。如果用2種不同密度相同碳含量的填料填充柱子，其保留行為將明顯不同,。因此,，單獨(dú)以碳含量來預(yù)測(cè)色譜行為是不夠的。
e. C18硅烷化試劑是一個(gè)大于2 nm大分子,，因此會(huì)與已鍵合在相鄰的硅醇基上的C18硅烷化試劑產(chǎn)生嚴(yán)重的立體位阻,。其結(jié)果導(dǎo)致在硅膠表面有大量的殘留硅醇基沒有與硅烷化試劑反應(yīng)，這些極性的硅醇基在一定色譜條件下會(huì)與堿性化合物相互作用引起峰形拖尾,，從而可影響定量分析結(jié)果,。這些問題在一定程度上可以通過烷基化處理加以克服。烷基化處理是在鍵合相上完成的獨(dú)立反應(yīng),，以減少在硅膠表面的硅醇基,。烷基化處理采用小分子(如*硅烷)的試劑，其空間位阻遠(yuǎn)小于C18基團(tuán),。大多數(shù)固定相僅有30%可覆蓋的鍵合位置,。據(jù)報(bào)道，通過某些極活躍的化學(xué)試劑及特殊的反應(yīng)條件,，zui高的覆蓋量可達(dá)50%,。很好地了解硅膠鍵合相的物理特性將有助于在液相色譜的反應(yīng)中選擇合適的色譜柱。表面上看C18柱雖然化學(xué)官能團(tuán)相同,，而實(shí)際上不同品牌的C18柱性能可能有很大差別,，從而產(chǎn)生不同的分離結(jié)果。
C18柱的規(guī)格對(duì)色譜柱的影響 柱填料的選擇關(guān)系到色譜分離的可能性,，而柱規(guī)格的選擇直接影響分析速度,、分離能力、檢測(cè)能力及每次分析的溶劑消耗等,。柱規(guī)格包括兩方面：柱內(nèi)徑和柱長(zhǎng)度,。柱內(nèi)徑，分析型一般為2～6 mm,制備型20 mm，大者可達(dá)80 mm,；柱長(zhǎng)度,，分析型5～30 cm，制備型15～50 cm,。一般來說,，柱內(nèi)徑不影響分離度與分析時(shí)間的關(guān)系。今天,，柱技術(shù)已發(fā)展到不同柱內(nèi)徑的柱子能夠具有相同的性能,。不同內(nèi)徑的柱子又各具特點(diǎn),，對(duì)相同的分析時(shí)間和分離度來說,，內(nèi)徑大的柱子比內(nèi)徑小的柱子多消耗溶劑。另一方面,，較小內(nèi)徑的柱子對(duì)相同的檢測(cè)信號(hào)來說所需樣品量亦較少,。因此，在樣品量有*,，可使用小內(nèi)徑柱,。柱長(zhǎng)度增加雖可改善分離效果，但阻力也隨之增加,，必須提高入口壓力,。柱壓是同時(shí)影響增加分離度和減少分析時(shí)間的主要障礙。分離度,、分析時(shí)間及柱壓三者相互制約,，選擇好其中兩者，則第3個(gè)因素也就選好了,。長(zhǎng)柱可以給出高分離度,，短柱可提供快速分離，我們可以根據(jù)樣品情況去選用合適的色譜柱,。
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