一、摘要：

1型糖尿病是一種會(huì)導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞破壞的自身免疫性疾病,，需要終身胰島素治療,。胰島移植提供了一個(gè)很有前途的解決方案，但也面臨著諸如可用性有限和需要免疫抑制等挑戰(zhàn),。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）為功能性β細(xì)胞提供了一個(gè)潛在的替代來(lái)源,，并具有大規(guī)模生產(chǎn)的能力。然而,，目前的分化方案,，主要是在混合或2D環(huán)境中進(jìn)行的，缺乏可延展性和懸浮培養(yǎng)的理想條件,。

我們研究了一系列可能影響分化過(guò)程的生物反應(yīng)器放大過(guò)程參數(shù),。該研究采用了一種優(yōu)化的HD-DoE協(xié)議，該協(xié)議設(shè)計(jì)具有可擴(kuò)展性,，并在0.5L（PBS-0.5 Mini）垂直輪式生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn),。

我們開(kāi)發(fā)了一種三階段的懸浮生長(zhǎng)過(guò)程，從貼壁培養(yǎng)過(guò)渡到懸浮培養(yǎng),，TB2培養(yǎng)基在規(guī)?；^(guò)程中支持iPSC的生長(zhǎng)。階段性?xún)?yōu)化方法和延長(zhǎng)分化時(shí)間用于增強(qiáng)iPSC衍生的胰島樣簇的標(biāo)記物表達(dá)和成熟,。連續(xù)的生物反應(yīng)器運(yùn)行被用于研究營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)的限制以及對(duì)分化的影響,。將連續(xù)生物反應(yīng)器與對(duì)照培養(yǎng)基變化生物反應(yīng)器進(jìn)行比較，顯示出代謝變化和更類(lèi)似b細(xì)胞的分化譜,。從試驗(yàn)中收集的低溫保存的聚集物被恢復(fù),，恢復(fù)后顯示出活力和胰島素分泌能力得到維持，這表明它們具有存儲(chǔ)和未來(lái)移植治療的潛力,。

本研究表明,，階段時(shí)間的增加或限制培養(yǎng)基補(bǔ)充以減少乳酸積累可以增加在大規(guī)模懸浮環(huán)境中培養(yǎng)的胰島素合成細(xì)胞的分化能力。

二,、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容節(jié)選：營(yíng)養(yǎng)消耗和代謝物的分析

       為了檢測(cè)細(xì)胞潛在的替代碳源和氮源,，我們分析了對(duì)照組和連續(xù)生物反應(yīng)器在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中的氨基酸代謝（圖S5A-B）。使用快速培養(yǎng)基氨基酸維生素分析儀Rebel（908 Devices）來(lái)分析氨基酸濃度,。必需氨基酸,，如組氨酸、異亮氨酸,、亮氨酸,、賴(lài)氨酸、蛋氨酸,、苯丙氨酸,、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸在整個(gè)培養(yǎng)期間都保持不變,。然而,，一些氨基酸在兩種培養(yǎng)基中都全部耗盡，包括5天后的L-天冬氨酸和16天后的L-谷氨酸,。氨基酸代謝對(duì)正常的胰腺β細(xì)胞功能至關(guān)重要,，丙氨酸和谷氨酰胺以其調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能和胰島素分泌的作用而聞名。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí),，谷氨酰胺和丙氨酸的濃度高于新鮮培養(yǎng)基,，表明它們不限制生長(zhǎng)（圖S5A-B）。然而,，它們?cè)黾拥膩?lái)源仍然未知,，不像之前的觀(guān)察而將它們的增加歸因于GlutaMAX™添加劑,。與起始培養(yǎng)基相比，丙氨酸和谷氨酰胺水平的升高在對(duì)照組生物反應(yīng)器中沒(méi)有觀(guān)察到,，后者在不同階段之間和整個(gè)延長(zhǎng)的內(nèi)分泌誘導(dǎo)階段都有頻繁的培養(yǎng)基變化,。兩種生物反應(yīng)器之間無(wú)其他顯著性差異。如前所述,，限制培養(yǎng)基補(bǔ)充的生物反應(yīng)器比對(duì)照培養(yǎng)基變化的生物反應(yīng)器具有更好的分化能力,。氨基酸濃度調(diào)節(jié)和血清缺乏與促進(jìn)來(lái)自人類(lèi)干細(xì)胞的胰腺β細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)。

       此外,，使用FLEX2（Nova Biomedical）對(duì)兩種培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估,，分析兩種反應(yīng)器的整個(gè)培養(yǎng)期間Gln、Glu,、NH4+,、Na+、K+,、Ca++,、pH、PCO2和PO2（圖S6A-B）,。在連續(xù)生物反應(yīng)器中,，培養(yǎng)基的滲透壓穩(wěn)定增加，但保持在280-320mOsm/kg范圍內(nèi),。這種增加可以歸因于由營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和其他廢物產(chǎn)生的溶質(zhì)的積累,。相比之下，對(duì)照培養(yǎng)基的滲透壓變化的生物反應(yīng)器隨著培養(yǎng)基在細(xì)胞分化過(guò)程的不同階段被補(bǔ)充而波動(dòng),。谷氨酰胺和谷氨酸水平也進(jìn)行了評(píng)估,，兩者都顯示隨著時(shí)間的推移而消耗。這與使用Rebel分析儀進(jìn)行的測(cè)量結(jié)果一致,。兩種生物反應(yīng)器在生物分化上具有可比性,，除了在連續(xù)生物反應(yīng)器中pH的持續(xù)下降和預(yù)期的耗氧速率方面的主要差異。在反應(yīng)液中測(cè)量的氣體可能會(huì)受到收集和測(cè)量之間時(shí)間的影響,，但是,，對(duì)所有樣品的總體影響是相同的?？傮w數(shù)據(jù)顯示,，在培養(yǎng)10天或PP誘導(dǎo)分化階段后，PO2水平開(kāi)始穩(wěn)步下降,。盡管反應(yīng)液與兩個(gè)生物反應(yīng)器頂空內(nèi)的氣體體積相同(500毫升）,，但與控制培養(yǎng)基補(bǔ)充變化生物反應(yīng)器相比，進(jìn)入反應(yīng)液的氧氣通量可能不足以補(bǔ)充0.5L連續(xù)容器中增加的耗氧量。