一、 摘要：

隨著Car-T細胞治療的發(fā)展,，測試不同的Car-T細胞,，并將代謝特征與表現良好且符合預期的Car-T細胞表型聯系起來,，使CAR構建和制造過程優(yōu)化。

Vasoactive intestinal peptide（VIP）是一種新興的T細胞功能的檢查通路,。

VIP在T細胞和腫瘤細胞中均有表達,，并在TCR激活過程中大量表達。在原代人類T細胞的擴增過程中,，VIP/VIPR軸的增強了分化程度較低的T細胞表型,、抗腫瘤細胞毒性和體內持久性。

通過工程改造Car-T細胞分泌新的,、有效的VIPR拮抗肽,，這些細胞可以克服對富含VIP的腫瘤微環(huán)境的免疫抑制（圖1）。拮抗T細胞中的VIP/VIPR軸可增強T細胞介導的抗腫瘤能力,。

在項目的這一部分,，我們研究通過培養(yǎng)基氨基酸分析來表征增強型Car-T細胞制造過程-將代謝特性與期望的、低分化和非耗竭型Car-T細胞族相關聯,。

二,、 實驗方法

為了研究VIPR拮抗劑是否影響代謝通路，我們使用快速培養(yǎng)基氨基酸維生素分析儀Rebel（908 Devices）進行了反應液分析,，以確定CAR和CAR/VIPRa T細胞之間的氨基酸使用差異,。培養(yǎng)基分析提供了在細胞胞外環(huán)境中化合物的消耗和積累的數據。

新鮮培養(yǎng)基和反應液分析顯示了,，丙氨酸,、谷氨酸和絲氨酸等氨基酸消耗的差異。這促使我們進一步研究這些Car-T細胞內代謝通路利用和代謝物改變的差異,。利用LC/MS代謝組學和細胞生物能學來闡明CAR和CAR/VIPRa T細胞代謝狀態(tài)之間的差異,。

完整的研究包括以下描述步驟：

● 體內-Car-T細胞功能和效力，以及壽命

          ⅰ,、熒光標記物腫瘤成像

● 顯微鏡法視覺評估細胞（數字形式,、形狀、表達生物標記）

          ⅰ,、評估T細胞的肽分泌

● RNA測序

● 海馬線粒體應激測試代謝呼吸狀態(tài)和應激

● 抗原刺激

          ⅰ,、試驗激活（如抗原刺激細胞因子和激活試驗）

          ⅱ、細胞毒性

          ⅲ,、增殖

● 流式細胞儀-具有特異性標記物的細胞數量和比例

● Rebel-新鮮培養(yǎng)基和反應液的氨基酸分析

● 蛋白質結合分析-效力和活性測定,，與抗原、抗體和底物等

三,、 快速培養(yǎng)基氨基酸維生素分析儀Rebel：隨時為您的生物過程調整提供參數指引

● 氨基酸,、維生素和生物胺的快速分析

● 最小所需樣品：低至10µL

● 簡單樣品準備：離心或過濾后稀釋

● 集成式自動分析儀：自動進樣器、分離、檢測,、分析和報告顯示

● 分析運行時間：~10分鐘每個樣品

● 試劑盒耗材：200次分析

四,、 結果

圖3. A：用新鮮培養(yǎng)基（RPMI+10%胎牛血清）分析了細胞培養(yǎng)基中氨基酸的起始濃度。值得注意的是高濃度的精氨酸,，而缺少丙氨酸,。

圖3.B和3.C：來自不同供體（3.B-樣品29和3）（3.C-樣品51）的反應液分析，顯示在培養(yǎng)終點非常相似的AA濃度水平,。值得注意的是,，反應液中丙氨酸的產生/分泌和精氨酸的顯著消耗，以及應激細胞和對照細胞樣本之間的差異,。

圖3.D對含VIP受體拮抗肽結構的氨基酸的進一步分析顯示,，培養(yǎng)終點的丙氨酸、谷氨酸和絲氨酸等氨基酸水平存在差異,。

圖4. A采用LCMS分析來研究細胞內代謝,，通過測定細胞內代謝物的豐度來確定不同代謝通路（糖酵解、TCA,、PPP,、AMP/ATP）的利用。

圖4.B線粒體應激實驗通過功能測定抗原刺激和對照細胞的糖酵解和氧化磷酸化利用,。

五,、 總結

我們發(fā)現，當細胞受到抗原刺激時,，CAR/VIPRa T細胞的能量明顯增加,。相比之下，Car-T細胞變得能量更少,，糖酵解作用更多,，這是T細胞衰竭的已知特征。此外,，用多種方法進行的代謝評估產生了與此評估相關的結果,，如耗氧量和反應液中的某些氨基酸水平。最后,，Car-T細胞活性、效力和細胞毒性評估顯示與抗腫瘤活性相關,?？傊@項工作表明,，不同的代謝特征證明CAR/VIPRa T細胞在抗原刺激時增強對腫瘤的作用,。