一,、 摘要：

隨著Car-T細(xì)胞治療的發(fā)展，測試不同的Car-T細(xì)胞,，并將代謝特征與表現(xiàn)良好且符合預(yù)期的Car-T細(xì)胞表型聯(lián)系起來,，使CAR構(gòu)建和制造過程優(yōu)化。

Vasoactive intestinal peptide（VIP）是一種新興的T細(xì)胞功能的檢查通路,。

VIP在T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá),，并在TCR激活過程中大量表達(dá)。在原代人類T細(xì)胞的擴(kuò)增過程中,，VIP/VIPR軸的增強(qiáng)了分化程度較低的T細(xì)胞表型,、抗腫瘤細(xì)胞毒性和體內(nèi)持久性。

通過工程改造Car-T細(xì)胞分泌新的,、有效的VIPR拮抗肽,，這些細(xì)胞可以克服對富含VIP的腫瘤微環(huán)境的免疫抑制（圖1）。拮抗T細(xì)胞中的VIP/VIPR軸可增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤能力,。

在項(xiàng)目的這一部分,，我們研究通過培養(yǎng)基氨基酸分析來表征增強(qiáng)型Car-T細(xì)胞制造過程-將代謝特性與期望的,、低分化和非耗竭型Car-T細(xì)胞族相關(guān)聯(lián),。

二、 實(shí)驗(yàn)方法

為了研究VIPR拮抗劑是否影響代謝通路,，我們使用快速培養(yǎng)基氨基酸維生素分析儀Rebel（908 Devices）進(jìn)行了反應(yīng)液分析,，以確定CAR和CAR/VIPRa T細(xì)胞之間的氨基酸使用差異。培養(yǎng)基分析提供了在細(xì)胞胞外環(huán)境中化合物的消耗和積累的數(shù)據(jù),。

新鮮培養(yǎng)基和反應(yīng)液分析顯示了,，丙氨酸,、谷氨酸和絲氨酸等氨基酸消耗的差異。這促使我們進(jìn)一步研究這些Car-T細(xì)胞內(nèi)代謝通路利用和代謝物改變的差異,。利用LC/MS代謝組學(xué)和細(xì)胞生物能學(xué)來闡明CAR和CAR/VIPRa T細(xì)胞代謝狀態(tài)之間的差異,。

完整的研究包括以下描述步驟：

● 體內(nèi)-Car-T細(xì)胞功能和效力，以及壽命

          ⅰ,、熒光標(biāo)記物腫瘤成像

● 顯微鏡法視覺評估細(xì)胞（數(shù)字形式,、形狀、表達(dá)生物標(biāo)記）

          ⅰ,、評估T細(xì)胞的肽分泌

● RNA測序

● 海馬線粒體應(yīng)激測試代謝呼吸狀態(tài)和應(yīng)激

● 抗原刺激

          ⅰ,、試驗(yàn)激活（如抗原刺激細(xì)胞因子和激活試驗(yàn)）

          ⅱ、細(xì)胞毒性

          ⅲ,、增殖

● 流式細(xì)胞儀-具有特異性標(biāo)記物的細(xì)胞數(shù)量和比例

● Rebel-新鮮培養(yǎng)基和反應(yīng)液的氨基酸分析

● 蛋白質(zhì)結(jié)合分析-效力和活性測定,，與抗原、抗體和底物等

三,、 快速培養(yǎng)基氨基酸維生素分析儀Rebel：隨時(shí)為您的生物過程調(diào)整提供參數(shù)指引

● 氨基酸,、維生素和生物胺的快速分析

● 最小所需樣品：低至10µL

● 簡單樣品準(zhǔn)備：離心或過濾后稀釋

● 集成式自動(dòng)分析儀：自動(dòng)進(jìn)樣器、分離,、檢測,、分析和報(bào)告顯示

● 分析運(yùn)行時(shí)間：~10分鐘每個(gè)樣品

● 試劑盒耗材：200次分析

四、 結(jié)果

圖3. A：用新鮮培養(yǎng)基（RPMI+10%胎牛血清）分析了細(xì)胞培養(yǎng)基中氨基酸的起始濃度,。值得注意的是高濃度的精氨酸,，而缺少丙氨酸。

圖3.B和3.C：來自不同供體（3.B-樣品29和3）（3.C-樣品51）的反應(yīng)液分析,，顯示在培養(yǎng)終點(diǎn)非常相似的AA濃度水平,。值得注意的是，反應(yīng)液中丙氨酸的產(chǎn)生/分泌和精氨酸的顯著消耗,，以及應(yīng)激細(xì)胞和對照細(xì)胞樣本之間的差異,。

圖3.D對含VIP受體拮抗肽結(jié)構(gòu)的氨基酸的進(jìn)一步分析顯示，培養(yǎng)終點(diǎn)的丙氨酸,、谷氨酸和絲氨酸等氨基酸水平存在差異,。

圖4. A采用LCMS分析來研究細(xì)胞內(nèi)代謝，通過測定細(xì)胞內(nèi)代謝物的豐度來確定不同代謝通路（糖酵解,、TCA,、PPP、AMP/ATP）的利用,。

圖4.B線粒體應(yīng)激實(shí)驗(yàn)通過功能測定抗原刺激和對照細(xì)胞的糖酵解和氧化磷酸化利用,。

五、 總結(jié)

我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞受到抗原刺激時(shí),，CAR/VIPRa T細(xì)胞的能量明顯增加,。相比之下，Car-T細(xì)胞變得能量更少,，糖酵解作用更多,，這是T細(xì)胞衰竭的已知特征。此外,，用多種方法進(jìn)行的代謝評估產(chǎn)生了與此評估相關(guān)的結(jié)果,，如耗氧量和反應(yīng)液中的某些氨基酸水平。最后,，Car-T細(xì)胞活性,、效力和細(xì)胞毒性評估顯示與抗腫瘤活性相關(guān)?？傊?，這項(xiàng)工作表明，不同的代謝特征證明CAR/VIPRa T細(xì)胞在抗原刺激時(shí)增強(qiáng)對腫瘤的作用,。