4.選擇使用適宜的流動相(尤其是pH),，以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱,，分析柱是鍵合硅膠時,，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”,，避免分析柱中的硅膠基質被溶解,。
5.經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質,。在進行清洗時,，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右。
?。ㄏ旅媪信e一些色譜柱的清洗溶劑及順序,，作為參考：硅膠柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次沖洗,，然后再以相反順序依次沖洗,，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質,，已烷使硅膠表面重新活化,。反相柱以水、甲醇,、乙腈,、一氯甲烷(或氯仿)依次沖洗，再以相反順序依次沖洗,。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液,，那么可以省略最后用水沖洗這一步。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂,。有時也注射二甲亞砜數(shù)次,。此外，用乙腈,、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗脫能除去蛋白質污染,。陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗,，除去交換性能強的鹽,，然后用水、甲醇,、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有機物),、甲醇、水依次沖洗,。）
7.色譜柱使用過程中，如果壓力升高,，一種可能是燒結濾片被堵塞,，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內(nèi),，使柱頭被污染,；如果柱效降低或色譜峰變形,，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,，死體積增大,。在后兩種情況發(fā)生時，小心擰開柱接頭,，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1～2mm高度(注意把被污染填料取凈)再把柱內(nèi)填料整平,。然后用適當溶劑濕潤的固定相(與柱內(nèi)相同)填滿色譜柱，壓平,，再擰緊柱接頭,。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平,。柱子失效通常是柱端部分,，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5～30mm)，可以起到保護,、延長柱壽命的作用,。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的,。通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上,。以硅膠為基質的填料，只能在pH=2～9范圍內(nèi)使用,。柱子使用一段時間后,，可能有一些吸附作用強的物質保留于柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙稀?/div>
8.新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷,，使柱效下降,，這時也可補加填料使柱效恢復。每次工作完后,，最好用洗脫能力強的洗脫液沖洗,，例如，ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡,。當采用鹽緩沖溶液作流動相時,，使用完后應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素(氟,、氯,、溴)的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸,。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用,，應每隔4～5天開機沖洗15分鐘。
高效液相色譜柱的正確使用
1.加裝保護柱的作用是過濾掉來自流動相和樣品的化學“拉圾”同時也可以有效除去流動相和樣品中的不溶物,。盡管現(xiàn)在的色譜儀在流動相吸入口,、進樣閥后部以及在色譜柱的兩端都裝有1,、2μm等不同孔徑的濾器,但濾器只能除去不溶性顆粒而不能除去化學污然,因此,加裝保護柱是必要的,特別是在分析中藥、中成藥等復雜混合物和生物樣品時更是保護分析柱的措施,。保護柱填料應與分析柱一致,粒徑可較分析柱大,。保護柱屬消耗品,經(jīng)過一定次數(shù)的樣品分析(50～100次)后,出現(xiàn)柱壓顯著升高或峰形變壞或基線漂移時,應考慮更換保護柱。
2.過濾流動相和樣品流動相通常由水或緩沖溶液與有機溶劑混合而成,原則上,所有經(jīng)過色譜柱的流動相均應過
濾,但在實際操作上應視具體情況而有所區(qū)別:當有機溶劑用色譜純級,水用石英亞沸水或其它超純水時,在能確保水和有機溶劑的質量且沒有受到污染時,過濾并無更多實際意義,。當流動相中含有緩沖鹽時,則過濾是必要的,如前所述,當緩沖溶液放置一段時間(視環(huán)境溫度不同而異,夏季一般不超過48h,冬季一般不超過一周)后,在使用前還應重新過濾,。所配制的樣品試液在注入流路系統(tǒng)前均要經(jīng)0.45μm（0.22μm則更好)孔徑濾膜過濾。要注意區(qū)分水系和油系,二者不可混用,以防止濾膜溶解而造成污染,。裝流動相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線濾器要定期清洗和更換,以避免濾器因過載而起不到過濾作用,。
3.凈化樣品當樣品中含有對色譜柱有損害的化學成分,如產(chǎn)生吸附的蛋白質、糖等有機分子和強吸附性物質,以及可能對柱填料產(chǎn)生破壞作用的基團離子,。在進樣前應盡可能對樣品進行分離提純以除去多余雜質組分,。
4.避免過高的柱壓雖然高效液相色譜柱能耐受的壓力可達6000psi(磅/平方英寸),但過高及過大的壓力變化均會縮短色譜柱的壽命,避免的方法是
(1)柱壓過高時,盡可能采用較小的流速,以不超過柱最大允許壓力的一半為宜。
(2)當流速較大時,應采取流速梯度的辦法使流速分步到位,。
(3)使用手動進樣閥時,進樣閥的切換要盡可能的快,。否則
超過20%的壓力沖擊會很快使柱報廢。當使用多柱聯(lián)用時,
柱切換要避免在高壓下進行,。
5.注意溫度和酸堿度
一般以硅膠為基質的色譜柱最高使用溫度不超過60℃,，以低于40℃為宜，特別是在流動相pH接近使用限度時,，更應降低使用溫度,。溫度過高會加快鍵合相的水解和硅膠的溶解，從而,，使填料性質改變,，柱床塌陷，降低柱效,，改變峰形,。目前的鍵合硅膠色譜柱標示的pH適用范圍可達2～10,但在實際使用時應避免的pH條件,特別是在偏堿性的條件(pH≥8)下使用,如必須要在的pH條件下使用時,可通過以下方法避免柱損害:
（1）在泵和進樣閥之間加裝預柱(飽和柱)來飽和流動相,；
?。?）降低使用溫度；
?。?）檢驗完畢后立即用與所使用的流動相互相混溶的“溫和溶劑”*清洗,；
6.正確及時的沖洗開始試驗前,應了解柱中當前是何種溶劑。對于新色譜柱,如無特殊說明均為評價報告中所用流動相,。柱中當前溶劑一定要與分析樣品所用流動相互溶,如不能混溶,要用與二者均能相互混溶的第三種溶劑過渡,。異丙醇是能與各種溶劑混溶的試劑,可作為中介流動相使用。反相鍵合硅膠柱適宜的保存環(huán)境是純甲醇,如分析用流動相為緩沖液2有機溶劑,可先用較低甲醇含量(<20%)的甲醇2水置換掉原來的純甲醇,再進分析用流動相,，以防止在柱內(nèi)發(fā)生鹽的沉淀,；試驗結束后,要及時用適當?shù)娜軇_洗系統(tǒng)并最終過渡到純甲醇沖洗,對于含有緩沖鹽的流動相,，辦法是先用與分析用流動相組成*相同但不含緩沖鹽的溶液進行沖洗，再逐步過渡到純甲醇沖洗,。多數(shù)報道沖洗液體積大約為柱容積的15～20倍,但最終要以基線是否平直,、壓力是否穩(wěn)定決定。有些廠家的色譜柱標明了流動相中有機相的低使用濃度為≥5%,使用時應給予注意,。
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