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血清脂蛋白的離心分離方法

閱讀：3681      發(fā)布時(shí)間：2012-7-23
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        利用不同容量的角式轉(zhuǎn)頭及很容易配制的梯度液,，在各種型號(hào)的超速離心機(jī)上都能得到滿意的分離結(jié)果。下面舉了幾個(gè)分離實(shí)例,，實(shí)際上還可以應(yīng)用于各種型號(hào)各種容量的固定角式轉(zhuǎn)頭,。

（一）梯度液

 
A液：11.40gNacl，0.1g EDTA-Na2,，置于1000ml量筒中加入500ml重蒸水及1
ml 1N NaOH,，混勻至全部溶解。加重蒸水至1000mlzui后再加3ml重蒸水（Nacl：0.195mol）,。終密度1.006g/cm3,，PH10.37。
B液：加24.98g NaBr 到100ml A液中,。終密度1.182g/cm3,。（Nacl：0.195mol， NaBr：7.65mol）,，PH9.72,。
C液：加78.32g NaBr 到100ml A液中。終密度1.478g/cm3,。（Nacl：0.195mol,， NaBr：7.65mol），PH8.86,。
（二）離心機(jī)及轉(zhuǎn)頭
• 離心機(jī)：Hitachi CP-MX系列超速離心機(jī)或其他類似機(jī)組,。
Hitachi CS-150GXL微量超速離心機(jī)。
• 轉(zhuǎn)頭,，離心管,；S 140 AT：140,000rpm,1,050,000×g，10×2ml,，K=5,，1PC厚壁管。
S 80 AT3：80,000rpm,415,000×g,，8×8ml,，K=23,，6PC厚壁管。
S 70 AT：70,000rpm,505,000×g,，8×40ml,，K=44，40PA管,。
（三）血漿-血球分離：
全血，角轉(zhuǎn)頭或甩平轉(zhuǎn)頭3000rpm×20min,，沉淀為血細(xì)胞,，上清血漿待用。
（四）乳糜粒分離
離心參數(shù)：各種轉(zhuǎn)頭均可用,，4×106（g×min）,，10℃
梯度液：離心管下部3/4容積為血漿，上部1/4容積為0.15MNacl+0.3MEDTA,。PH7.4,。
離心結(jié)果：乳糜粒上浮，離心管傾斜,，吸管貼管壁慢吸出（約占血漿容積的2~6%,。禁令12小時(shí)以上供血者血漿中乳糜含量很低，食后供血者含量較高,。
（五）血清脂蛋白分離
VLDL分離（ρ<1.006g/cm3）
轉(zhuǎn)頭
離心管內(nèi)液體分布
離心參數(shù)
結(jié)果
S140AT
（CS-150GXL機(jī)組）
下部600μl血漿
上部300μl A液
140,，000rpm×50min
16℃
加速：5
減速：7
可見明顯分層上部約1/3VLDL吸出
S80AT3
（CS-150GXL機(jī)組）
下部3.4ml血漿
上部1.7mlA液
80，000rpm×4.5hrs
16℃
加速：5
減速：7
同上
P70AT
（CP-MX機(jī)組）
下部24ml血漿
上部11.7ml A液
70,，000rpm×8hrs
16℃
加速：5
減速：7
同上
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LDL（含IDL）分離（1.006g/cm3<ρ<1.063g/cm3）
 
轉(zhuǎn)頭
離心管內(nèi)液體分布
離心參數(shù)
結(jié)果
S140AT
（CS-150GXL機(jī)組）
*次離心后上部VLDL取出,，下部600μl移入另一離心管，加入300μl B液,，充分混合
140,，000rpm×80min
16℃
加速：9 減速：7
上部1/3體積LDL+IDL吸出
S80AT3
（CS-150GXL）
*次離心后上部VLDL吸出，,，下部3.4ml移入另一離心管,，加入1.7ml B液并充分混合
80，000rpm×5.5hrs
16℃
加速：9減速：7
上部1/3體積LDL+IDL吸出
P70AT
（CP-MX系列超速機(jī)或類似機(jī)型）
*次離心后上部11.7ml吸出,，下部約24ml 移入另一離心管,，加入11.7ml B液，充分混合
70,，000rpm×10hrs
16℃
加速：9 減速：6
上部1/3體積LDL+IDL吸出
 
HDL分離（1.063g/cm3<ρ<1.21g/cm3）
 
轉(zhuǎn)頭
離心管內(nèi)液體分布
離心參數(shù)
結(jié)果
S140AT
（CS-150GXL機(jī)組）
第二次離心后吸出上部300μl后,，下部600μl移入另一離心管，加入300μl C液,，充分混合
140,，000rpm×140min
16℃
加速：9
減速：7
可見較明顯分層，
上部為HDL，下部為血清白蛋白及球蛋白
S80AT3
（CS-150GXL機(jī)組）
第二次離心后吸出上部約1.7ml,、下部3.4ml移入另一離心管,，加入1.7ml C液，充分混合
80,，000rpm×8小時(shí)
16℃
加速：9
減速：7
可見較明顯分層,，
上部為HDL，下部為血清白蛋白及球蛋白
P70AT
（CP-MX系列機(jī)或其他類型機(jī)組）
第二次離心后吸出上部1/3,、下部2/3移入另一離心管,，加入約12ml C液，充分混合
70,，000rpm×15小時(shí)
16℃
加速：9
減速：6
可見較明顯分層,，
上部為HDL，下部為血清白蛋白及球蛋白
 

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