5.3
皮膚的凍干
凍干皮膚在醫(yī)學(xué)上的臨床應(yīng)用研究始于20世紀(jì)50年代,。動(dòng)物皮膚的凍干目的是用于對(duì)藥物經(jīng)皮膚滲透性的研究。由于透皮吸收給藥新型的問世,，藥物經(jīng)皮滲透性的研究正成為開發(fā)這類新型篩選藥物的重要手段,，由于大量長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)物皮的需求，實(shí)際應(yīng)用時(shí)常將待用皮放在冰箱里,，可保存1周左右,。時(shí)間再長(zhǎng)，不但影響藥理實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性,，而且皮膚將變質(zhì),。為增長(zhǎng)皮膚保存期，可將動(dòng)物皮膚凍干保存,；人類皮膚凍干的目的是用于再植,，為燒傷或外傷皮膚的病人植皮。
5.3.1 大鼠皮膚凍干工藝及藥物滲透性實(shí)驗(yàn)
東北大學(xué)的鄭文利博士早在20世紀(jì)末就進(jìn)行了大鼠皮膚凍干的實(shí)驗(yàn)研究,。取活大鼠脫頸處死后,，立即用電動(dòng)去毛刀去其腹部鼠毛，剝離皮膚,，除去皮下脂肪層,、血管及殘留物，用蒸餾水沖洗干凈,，制成不同尺寸的皮片,，再用生理鹽水沖洗數(shù)次備用。將制備好的大鼠皮放在速率降溫儀中,，以-5℃/min,、-l5℃/min、-30℃/min三種不同速率降溫至-30℃,。將三種不同降溫速率預(yù)凍的大鼠皮,，分別放入小型凍干機(jī)中抽真空，30min后壓力穩(wěn)定在120Pa,不主動(dòng)加熱,，連續(xù)干燥34h后關(guān)機(jī),，充氮?dú)夂笕〕觯脽o菌塑料袋封裝后,，放在干燥器內(nèi)保存,。
將以不同預(yù)凍速率凍干的大鼠皮膚,，經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋制片,，進(jìn)行病理切片,，切片厚度4～5μm,HE染色，再顯微鏡觀察,。新鮮大鼠皮組織切片如圖5-8所示,，以5℃/min速率預(yù)凍并凍干大鼠皮組織切片如圖5-9所示。從圖中可以看出凍干皮組織與新鮮皮組織相本相同,，未見細(xì)胞破裂,、上皮脫離、組織褶皺,、細(xì)胞變性和細(xì)胞間隙增寬等異常,，說明凍干皮組織結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化。其他速率預(yù)凍并凍干后的結(jié)果基本一致,。
凍干大鼠皮角質(zhì)細(xì)胞間隙脂流動(dòng)性的電子自旋共振(ESR)測(cè)定：選 用5-噁唑氮氧自由基硬質(zhì)酸(5-DSA)作為自旋轉(zhuǎn)標(biāo)記物,，將新鮮的和 三種不同預(yù)凍速率的凍干大鼠皮角質(zhì)層樣品泡在濃度為1×10-4mol/L 的5-DSA緩沖液(pH=7.4)中12h，保溫20℃,，然后取出淋洗干凈,，37℃烘箱干燥1h，分別放進(jìn)電子自旋共振波譜儀樣品管內(nèi),，再置于腔中,。ESR測(cè)定條件：掃描寬度200G，接收增益3.2×104,，時(shí)間常數(shù)20.48ms,，微波功率5.02mW，掃描時(shí)間83.888s,，調(diào)制頻率 25.000kHz,，調(diào)制幅度0.947G。經(jīng)ESR波譜分析得知,，三種不同凍 結(jié)速率預(yù)凍的凍干大鼠皮與新鮮大鼠皮各系數(shù)相比無顯著差異,，說明 凍干大鼠皮膚未引起表皮細(xì)胞間脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，大鼠表皮角質(zhì)細(xì)胞 間脂質(zhì)排列的有序性沒有改變,，流動(dòng)性沒有增加,。
實(shí)驗(yàn)采用尼莫地平為模型藥物（一種腦血管擴(kuò)張藥），選用預(yù)凍速 率為l5℃/min的凍干大鼠皮和新鮮大鼠皮做藥物滲透性實(shí)驗(yàn),，考察其 組織結(jié)構(gòu)有無變化,。實(shí)驗(yàn)采用裝置為V-lia-chien水平擴(kuò)散池。它是由 兩個(gè)等容積的玻璃半池組成,，半池內(nèi)徑為l.35cm,，有效擴(kuò)散面積為 1.43cm2,，容積為10mL。半池上方開口為取樣口,，池底有凹陷平 臺(tái),，起到固定攪拌的作用。實(shí)驗(yàn)時(shí)將皮膚固定在擴(kuò)散池的兩個(gè)半池之 間,，角質(zhì)層面向供體池,。水化1h后，供體池加入10mL尼莫地平的 30%丙二醇水過飽和溶液,，接受池中加入10mL的30%丙二醇水，置 于32℃溫水浴中,，磁力攪拌,，定時(shí)取樣并更換全部接收介質(zhì)。樣品經(jīng) 徽孔濾膜(0.45nm)過濾,，續(xù)濾液,，樣品進(jìn)人高效液相測(cè)定。尼莫地平 外含量測(cè)定采用高效液相色譜法紫外檢測(cè),。色譜條件：色譜柱 Spherisorb46mm×25cm,，檢測(cè)波長(zhǎng)237nm，流動(dòng)相是甲醇/水 (64/36),，流速為1.1mL/min,，進(jìn)樣量10μL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5-11所 示,。
表5-11正常皮膚和凍干皮膚對(duì)尼莫地平滲透量比較
表5-11中的數(shù)據(jù)表明,，在滲透9、10h,、12h時(shí),，凍干皮膚與正常皮膚對(duì)藥物尼莫地的滲透量無顯若性差異?？梢?，凍干的大鼠皮膚能夠滿足藥理的實(shí)驗(yàn)要求，可用做透皮制的實(shí)驗(yàn)研究,，可以長(zhǎng)期貯存?zhèn)溆谩?/span>
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