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直到最近,，熒光照明是一個(gè)選項(xiàng)僅適用于配備專門(mén)的高數(shù)值孔徑物鏡的研究級(jí)復(fù)合顯微鏡。這一技術(shù)在立體顯微鏡的需要不斷升級(jí)與引進(jìn)的編碼基因和生物特異性熒光蛋白GFP（綠色熒光蛋白）等,。

體視顯微鏡的應(yīng)用GFP觀察現(xiàn)在是如此普遍,，立體聲熒光照明，更經(jīng)常被稱為GFP照明,，即使他們可以利用許多其他應(yīng)用在生命科學(xué)和電子制造業(yè),。大幼蟲(chóng)，線蟲(chóng),，斑馬魚(yú),，卵母細(xì)胞和成熟的昆蟲(chóng)標(biāo)本，如可以方便地選擇和操作時(shí),，他們GFP標(biāo)記的照亮熒光技巧,。熒光照明揭示生物體產(chǎn)生熒光蛋白耦合到一個(gè)大領(lǐng)域的視野和充足的工作距離和立體視覺(jué)，使觀察員進(jìn)行實(shí)驗(yàn),，用鉗子,，移液器，或顯微操作。其他更傳統(tǒng)的標(biāo)本也很容易觀察和記錄使用立體顯微鏡熒光照明,。

落射熒光照明功能的方式是類似上采用更復(fù)雜的復(fù)合顯微鏡體視顯微鏡上,。通常情況下，在熒光照明器由包含在經(jīng)由中間管（或垂直照明,，其安裝到顯微鏡外部燈箱的氙燈或汞弧燈,，見(jiàn)圖1和2）之間的的顯微鏡放大本體和觀察管定位。目前僅限于這種類型的照明采用共同的主要物鏡（CMO）立體顯微鏡的應(yīng)用,，因?yàn)樗皇强梢允褂玫氖惺鄣牧慵?，以適應(yīng)一個(gè)的格里諾或聚光型體視顯微鏡熒光照明。

弧燈產(chǎn)生的光被引導(dǎo)通過(guò)一個(gè)可調(diào)節(jié)的聚光透鏡的組合過(guò)濾器塊（圖2和圖3中示出）,，它允許weiyi的光具有特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)（或帶通）,，通過(guò)容納在激發(fā)濾光片。過(guò)濾的光,，然后通過(guò)顯微鏡成像的下部的顯微鏡（放大的身體和客觀的在體視顯微鏡）的路徑和到標(biāo)本偏轉(zhuǎn),，也調(diào)諧到選擇性地過(guò)濾由二色鏡，反射,，和/或發(fā)送一個(gè)特定的波長(zhǎng)區(qū)域設(shè)置,。的術(shù)語(yǔ)二色性（或二色性）是指過(guò)濾器或反射鏡的能力來(lái)區(qū)分兩種顏色的范圍，超過(guò)該限制反射特定波長(zhǎng)極限以下的顏色,，而這些波長(zhǎng)發(fā)送,。

聚焦的激發(fā)光通過(guò)顯微鏡放大主體和物鏡，在那里形成一個(gè)倒錐形的照明,，沐浴試樣,，令人興奮的任何存在的熒光基團(tuán)，并且有對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)的帶通范圍內(nèi)的吸收帶的,。二次熒光發(fā)射（通常比的激發(fā)光更長(zhǎng)的波長(zhǎng)）從試樣發(fā)出的捕捉體視顯微鏡的常見(jiàn)的主要物鏡,，并通過(guò)放大機(jī)構(gòu)和阻擋濾波器直接回，塊激發(fā)波長(zhǎng),，并只允許一個(gè)選定的區(qū)域發(fā)射波長(zhǎng)通過(guò),。在圖1和圖2中的顯微鏡體管構(gòu)成，波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光發(fā)射光通過(guò)左側(cè)和右側(cè)的放大光信道傳遞到達(dá)落射熒光照明器之前獨(dú)立地集中,。光從左邊的通道直接穿過(guò)屏障過(guò)濾器前觀察管或直接進(jìn)入到相機(jī)端口,。與此相反，右聲道的光從第一行駛回然后通過(guò)二色鏡的屏障過(guò)濾器和目鏡,。此燈不到相機(jī)端口的途徑,，只能用于觀察標(biāo)本。

列于圖2和3的熒光過(guò)濾器的組合塊的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié),。每個(gè)塊包含一個(gè)單一的激發(fā)濾光器,，兩個(gè)屏障過(guò)濾器和一個(gè)二色鏡。汞弧燈產(chǎn)生的光通過(guò)激發(fā)濾光片進(jìn)入塊，如上所討論的,，圖3中所示的二色性反射鏡的表面被反射,。次級(jí)熒光發(fā)射通過(guò)阻擋過(guò)濾器。激發(fā)光濾光片,，二色鏡,，用于左聲道的屏障過(guò)濾器粘到的地方，但是,，用于右聲道的屏障過(guò)濾器被安裝在一個(gè)小的幀可以通過(guò)擰松固定螺釘?shù)囊唤M從塊中刪除,。卸下屏障過(guò)濾器框架允許訪問(wèn)定位在過(guò)濾器內(nèi)的塊的二色鏡,。當(dāng)粘合成塊,，更換過(guò)濾器小心，不要蔓延到過(guò)濾器表面的膠水和不持有的過(guò)濾器或雙色鏡用沒(méi)戴手套的手,，以避免污染的表面油膩指紋,。

熒光垂直照明可以容納三濾的塊和一個(gè)直徑過(guò)濾虛擬塊（沒(méi)有過(guò)濾器），使正常的明場(chǎng)觀察,。過(guò)濾器塊被安裝在滑動(dòng)架中,，并且可以被插入到光路中，是用來(lái)控制齒條位置的桿通過(guò),。每個(gè)塊都有一個(gè)附帶的識(shí)別板,，其可插入順序排列，以使操作者能夠容易地選擇適當(dāng)?shù)膲K,，用于熒光觀察的照明裝置的外部殼體上的插槽,。

目前，尼康提供一個(gè)適度的過(guò)濾器組合的陣容,，這是表1中列出,。這些過(guò)濾器涵蓋了廣泛的熒光激發(fā)和發(fā)射條件，應(yīng)該是有用的許多普遍使用的熒光探針在生物學(xué)研究,。該過(guò)濾器的組合,，也適用于工業(yè)應(yīng)用，如熒光照片污染集成電路晶片檢查抗蝕劑聚合物,。激發(fā)波長(zhǎng)介于380和510納米熒光探針,，可以用來(lái)選擇合適的激發(fā)/發(fā)射過(guò)濾器組合（見(jiàn)表1）。該過(guò)濾器的組合也是非常有用的研究,，采用各種綠色熒光蛋白的突變體,，包括青色和藍(lán)色的版本。

在活的細(xì)胞培養(yǎng)物,，具有熒光蛋白標(biāo)簽,，可以顯著提高的信號(hào)強(qiáng)度，過(guò)濾器的組合時(shí)，是嚴(yán)格匹配的熒光激發(fā)和發(fā)射的檔案,。例如,，在DS-紅信號(hào)，視覺(jué)和圖像傳感器檢測(cè)到的紅色熒光的情況下,，可以顯著提高的紅色信號(hào)通過(guò)轉(zhuǎn)移更多的橙色發(fā)射,。此外，專為植物標(biāo)本具有強(qiáng)烈的自體熒光背景葉綠素排放的過(guò)濾器組合往往受益于仔細(xì)和精確的選擇過(guò)濾器的規(guī)格,，就到相應(yīng)的信號(hào)發(fā)射,。顯微鏡工程師采取許多這些設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)考慮到他們正在優(yōu)化波長(zhǎng)帶通過(guò)濾器組合體視顯微鏡地區(qū)。

體視顯微鏡熒光濾光片組合

組合塊過(guò)濾器和其它敏感的干涉濾光片,，將隨時(shí)間而變質(zhì)時(shí)暴露在高強(qiáng)度的光,，紫外線的波長(zhǎng)。作為帶通頻率和傳輸值的特性,，例如,，如果過(guò)濾器被暴露于高濕度條件下也可能受到影響。為了增加這些過(guò)濾器的使用壽命,，他們應(yīng)該被儲(chǔ)存在干燥器中或含有干燥劑的密封容器中,。另外，還可減少光通過(guò)過(guò)濾器的保持照明快門(mén)關(guān)閉標(biāo)本時(shí)不被直接觀察或用數(shù)碼或膠卷的照相機(jī)系統(tǒng)成像的時(shí)間量,。該過(guò)濾器只應(yīng)用干燥空氣清潔從耳氣球,，軟駝刷，或無(wú)油的加壓氣瓶,。不要試圖擦拭鏡頭紙過(guò)濾器,，以避免劃傷或擦傷，軟干擾涂層的表面,。

尼康SMZ1500如用立體顯微鏡,，廣泛的標(biāo)本，可以在熒光照射下成像,。物鏡的放大倍率為0.5倍至15倍的1.6倍的變焦跨度,，在顯微鏡能夠540X，考慮到的一個(gè)經(jīng)典的化合物顯微鏡體視顯微鏡觀察范圍內(nèi),，共提供4倍的倍率廣度,。這種廣泛的緯度使顯微鏡的放大倍率形象都大活標(biāo)本和熒光標(biāo)記的薄切片在顯微鏡玻片上安裝微小的細(xì)節(jié)上。熒光觀察的高倍率范圍內(nèi)的一個(gè)例子示出在圖4中的三重標(biāo)記的小鼠腎組織的粗節(jié),。標(biāo)記的Alexa Fluor 488的WGA,，用DAPI的Alexa Fluor 568（得自Molecular Probes公司的Alexa Fluor探針和試樣）試樣，并使用三個(gè)過(guò)濾器的組合列于表1：藍(lán)綠色熒光蛋白/ DAPI,，成像賦予GFP的帶通濾波器,，和TRITC DsRed的,。此圖片清楚地說(shuō)明了高倍率能力原本準(zhǔn)備復(fù)合顯微鏡觀察標(biāo)本的

熒光體視顯微鏡。

其他體視顯微鏡制造商提供替代照明策略,，激發(fā)和觀察,。流行的配置，如圖5所示,，熒光激發(fā),，不利用顯微鏡的成像光學(xué)系統(tǒng)包括一個(gè)外部通路。照明從電弧燈箱的第一通過(guò)激發(fā)濾光片,，然后通過(guò)管定位在主顯微鏡主體的后部,。管的下部配備的透鏡系統(tǒng)，引導(dǎo)到樣品上的激發(fā)光波長(zhǎng),。此配置可確保光線被直接引導(dǎo)到標(biāo)本在所有倍率變焦位置,，提供所有倍率同樣強(qiáng)烈的熒光照明均勻暗背景。

從被捕獲的標(biāo)記的試樣中熒光發(fā)射通過(guò)的共同的主要物鏡（圖5）,，并通過(guò)變焦頻道和屏障過(guò)濾器定位在顯微鏡頭成一組,。從那里時(shí)，光被引導(dǎo)到目鏡直接觀察或成數(shù)字成像或顯微攝影攝像管,。此配置中的主要好處是缺乏的二色性反射鏡的一個(gè)要求，和獨(dú)立于預(yù)先配置的過(guò)濾器的組合塊,，這使得研究者有所更自由地進(jìn)行過(guò)濾器的選擇,。但是，配置也可能導(dǎo)致錯(cuò)誤,，缺乏經(jīng)驗(yàn)的運(yùn)營(yíng)商試圖觀察標(biāo)本不正確的過(guò)濾器組合,。

熒光觀察在立體顯微鏡提供的*的屬性的三維觀察時(shí)相比，提出的一個(gè)古典化合物顯微鏡的視圖,。此外,，更大的工作距離和景深立體技術(shù)所提供的啟用更寬的全景視圖字段和更強(qiáng)烈的熒光。這些功能是巨大的利益,，調(diào)查人員正試圖處理大量的生物標(biāo)本和材料的技術(shù)人員正在開(kāi)展準(zhǔn)備工作,，如嵌入，電子檢查,，或切割,。作為更清楚地定義的過(guò)濾器組合成為可用于專門(mén)的應(yīng)用程序，利用熒光立體顯微鏡繼續(xù)攀升,。