YIJI組織IKKβ激酶活性光譜法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI組織IKKβ激酶活性光譜法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過人工合成多肽底物,，在IKKβ激酶敏感性抑制劑存在與否的情況下,，受到IKKβ磷酸化后,，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定產(chǎn)生ADP過程中,，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng),， 即采用光譜法測(cè)定其氧化后峰值的變化，以分析組織裂解樣品中IKKβ特異活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法,。該技術(shù)經(jīng)過精心研制,、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動(dòng)物,、人體）,、部分或*純化酶樣品中IKKβ激酶的定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選,。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,，即到即用，操作簡(jiǎn)捷,，性能穩(wěn)定,，高度敏感。

技術(shù)背景

B細(xì)胞κ輕鏈多肽基因促動(dòng)子抑制劑激酶復(fù)合物（Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells,，kinase complex,；IκB kinase；IKK,；EC 2.7.11.10）,，是NF-κB信號(hào)通路中的成員之一，由3個(gè)亞體構(gòu)成：IKKα,，又稱為IKK1或CHUK（conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase）,；IKKβ，又稱為IKK2或IKBKB,；IKKγ,，又稱為NEMO或IKBKG。ITI1,、GPRK2L,、GPRK4，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬中鳥苷酸結(jié)合蛋白偶聯(lián)受體激酶（guanine nucleotide-binding protein-coupled receptor kinase,；GRK）亞系成員之一,。多基因GRK亞系由6個(gè)成員構(gòu)成，分成3類：包括GRK1（視網(wǎng)膜色素激酶家系,；rhodopsin kinase）,、GRK2/3（β腎上腺素能受體激酶；β-adrenergic receptor kinase）以及IKK/5/6（IKK激酶）,。其中G蛋白偶聯(lián)受體激酶4至少有4種變異體：IKKα,、β、γ,、δ,，在睪丸組織中高度表達(dá)。IKK使G蛋白偶聯(lián)受體,，例如多巴胺等去敏化（desensitization）,、以及精子授精等有關(guān)。其目標(biāo)蛋白為活化的G-蛋白偶聯(lián)受體蛋白,，進(jìn)行磷酸化后,，抑制其功能。其功能異常將導(dǎo)致遺傳性或獲得性高血壓等疾病,。其磷酸化目標(biāo)序列為RRREEEEESAAA,。基于底物RRREEEEESAAA，在IKKβ激酶敏感性抑制劑5-苯基-3-脲啶噻吩-2-甲酰胺（(5-phenyl-3-ureido)-thiophene-2-carboxamide）存在與否的情況下,，受到IKKβ激酶的磷酸化,，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase,；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中,，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,；NAD）,，其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析IKKβ的特異活性,。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）   毫升

YIJI裂解液（Reagent B）   毫升

YIJI緩沖液（Reagent C）  毫升

YIJI酶促液（Reagent D）  微升

YIJI反應(yīng)液（Reagent E）  微升

YIJI底物液（Reagent F）   微升

YIJI陰性液（Reagent G）  微升

YIJI專性液（Reagent H）  微升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里,；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融,；有效保證6月

用戶自備

IKKβ激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于組織預(yù)處理

比色皿或酶標(biāo)板：用于光譜分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光譜分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 待測(cè)樣品準(zhǔn)備

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織,，并秤重500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗
• （選擇步驟）抽去清理液
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐隔夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入置于冰槽里的xx微升YIJI裂解液（Reagent B） 
• 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒,，充分混勻
• 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘,，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/span>）
• 即刻放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,，速度為10000g 
• 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

• 測(cè)定準(zhǔn)備
• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如組織裂解懸液等）,，置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔1分鐘,，讀數(shù)6次（共5分鐘）,，并置零
• YIJI緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
• 背景對(duì)照測(cè)定
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘
• 樣品總活性測(cè)定
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入5微升待測(cè)樣品（注意：50微克組織裂解蛋白,；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘 
• 樣品非特異活性測(cè)定

檢測(cè)開始前,，移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升YIJI專性液（Reagent H）和待測(cè)樣品（注意：50微克組織裂解蛋白）,，混勻后,，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作,。

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
• 上下傾倒數(shù)次,，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘
• 計(jì)算樣品活性
• 樣品總活性和非特異活性計(jì)算

2）樣品特異活性計(jì)算

七,、酶標(biāo)板測(cè)定

1）樣品總活性測(cè)定

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板中
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50微克組織裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：
• 樣品非特異活性測(cè)定

檢測(cè)開始前,，移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升YIJI專性液（Reagent H）和待測(cè)樣品（注意：50微克組織裂解蛋白）,，混勻后,，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作,。

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測(cè)樣品
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板中
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：
• 樣品特異活性計(jì)算

八,、抑制劑篩選

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景,、*活性和待測(cè)抑制劑樣品
• 按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理

• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
• 即刻放進(jìn)30℃酶標(biāo)儀檢測(cè)：測(cè)讀30分鐘
• 抑制活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為25次操作,，包括背景操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中,，背景測(cè)定只需1次
• 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液 
• 樣品須澄清,，至關(guān)重要 
• 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測(cè)定
• 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù)30分鐘
• 光譜測(cè)定后,，比色皿須清洗*
• 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1） 
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低,，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用IKKβ抑制劑作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
• IKKβ活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下,，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列蛋白激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

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