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一,酶免疫電泳技術(shù)的原理
抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí),,在堿性緩沖液的條件下,,抗原帶負(fù)電,向正極移動(dòng),。不同分子量或還不同電荷的抗原,,在相同條件下,移動(dòng)距離不等,。這些在不同部位的抗原,,再與相關(guān)抗體經(jīng)擴(kuò)散形成免疫沉淀線。酶免疫電泳技術(shù)中的抗原與抗體就是酶和它的相應(yīng)抗體球蛋白,。酶抗原與酶抗體形成的免疫復(fù)合物是用底物顯色的,,由于酶反應(yīng)的高度靈敏性,使酶免疫電泳技術(shù)成為一項(xiàng)靈敏度高的檢測(cè)技術(shù),,但僅局限于酶蛋白的分析鑒定,。
二,辣根過(guò)氧化物酶(HRP)免疫電泳技術(shù)的程序
1,, 器材與設(shè)備
電泳儀(包括電泳槽),;溫箱;載玻片(7.5cm×2.5cm);小玻棒(長(zhǎng)4cm左右,,直徑約1.5mm),;打孔器;鋪有濕紗布的帶蓋搪瓷盒,。
2,, 材料與試劑
感染病毒的植物病葉,健株葉片作對(duì)照,;辣根過(guò)氧化物酶(精制)制備的兔抗酶抗體,;瓊脂糖;0.1mol/pH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液,;底物與供氫體混合液(H2O2和DAB-4HC1),。
3,,實(shí)驗(yàn)程序
(1)將小玻棒放在潔凈的載玻片中央,然后將3ml溶化的瓊脂糖溶液(0.8g瓊脂糖/100ml巴比妥鈉鹽酸緩沖液)澆制其上,,待冷凝后,,用針尖挑去玻棒,中央出現(xiàn)一穴槽,。
(2)在穴槽一端的兩側(cè)近邊沿2mm處各打一小孔(直徑2-3mm),在一孔穴中加入健株葉片汁液,,在另一孔穴加入感染病毒的植株葉片汁液。
(3)加汁液的孔穴一端接負(fù)極,,電泳緩沖液仍是0.1mol/LpH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液,,電壓150V,電泳1h,。
(4)在穴槽加入抗HRP兔血清,,置于濕盒中,在37℃溫箱中反應(yīng)3h左右或室溫過(guò)夜,。
(5)在生理鹽水中浸洗3-4天,,每天換水3次。
(6) 敷上干凈的濕濾紙,,置于40℃烘箱內(nèi)烘干,。
(7)浸入底物顯色,從沉淀弧的形狀,,部位不同,,比較健,病汁液所形成的沉淀線,。
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