1.冷凍保存方法:

(1)傳統(tǒng)方法:冷存管置于4C10分鐘-->-20C30分鐘-->-80C 16~ 18小時(或隔夜)-->液氮槽vaporphase長期儲存,。

-20C不可超過1小時,，以防止胞內(nèi)冰晶過大,，造成細胞大量死亡,，亦可跳過此步驟直接放入-80C冰箱中,，惟存活率稍微降低一些。

(2)程序降溫:利用已設定程序的等速降溫機以-1~-3C/分鐘之速度由室溫降至(-80C以下) -120C,，再放在液氮槽vaporphase長期儲存,。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。

(3)HAKATA無血清細胞凍存： 加入HAKATA無血清細胞凍存液制成懸液,，直接凍于-80°C,，可保存≥5年。

2.操作步驟:

(1)冷凍前24-48小時更換半里或全里培養(yǎng)基,，使細胞處于指數(shù)生長期,。

(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):另取一離心管，加入培養(yǎng)基,、血清,，逐滴加入二甲基亞礬(DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液,，置于室溫下待用,。

(3)離心收集培養(yǎng)之細胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細胞,，取少里細胞懸浮液(約0.1m1)計數(shù)細胞濃度及凍前存活率,。

(4)取與細胞懸液等里的凍存液，緩慢逐商加入細胞懸液,，并晃動試管,，制成細胞凍存懸液( DMSO后濃度為5~ 10%)，使細胞濃度為1~5x 10*cells/ml,，混合均勻,，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1~ 2nl/mal,并取.少里細胞懸浮液作污染檢測,。嚴密封口后,，注明細胞名稱、代數(shù),、日期。然后進行凍存,。