沙丁胺醇檢測試劑盒使用說明書

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測尿樣,、組織,、飼料等樣本中的沙丁胺醇（Salbutamol,，SAL）,，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物,、抗體,、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時,，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,，樣本中的沙丁胺醇和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗沙丁胺醇抗體，加入酶標(biāo)記物后,，用TMB底物顯色,，樣本吸光度值與其所含沙丁胺醇含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中沙丁胺醇的殘留量,。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃,，30min～15min

2.3 檢測下限：

尿液、組織………………………0.1ppb

飼料………………………………1ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

沙丁胺醇…………………………100%

鹽酸多巴酚丁胺…………………7.2%

西馬特羅…………………………0.1%

克倫特羅…………………………3.6%

萊克多巴胺………………………0.1% 

腎上腺素…………………………0.1%

異丙腎上腺素……………………<1%

 2.5 樣本回收率：

尿樣……………………………………90%±10% 

組織……………………………………80%±10% 

飼料……………………………………80%±15%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml

0ppb、0.1ppb,、0.3ppb,、0.9ppb、2.7ppb,、8.1ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb………1ml

酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml

抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

10X復(fù)溶液(黃蓋)…………………50ml

說明書………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀,、打印機(jī)、均質(zhì)器 ,、氮氣吹干裝置,、振蕩器、離心機(jī),、刻度移液管,、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl,、多道300µl

4.3 試劑：氫氧化鈉,、乙酸乙酯、濃HCl,、乙腈,、異丙醇、正己烷,、無水硫酸鈉 

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭,，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：1M鹽酸溶液

    稱取8.6ml濃HCl加去離子水至100ml,。

配液2：1M NaOH 溶液

    稱取4g NaOH加去離子水至100ml,。

配液3：復(fù)溶液

    將10×復(fù)溶液用去離子水10倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶,，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月,。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 尿樣本處理方法

    直接取50µl清亮尿樣進(jìn)行測定（渾濁尿樣需要過濾或經(jīng)4000r/min離心5min，以得到清亮尿樣）,，暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存,。

    尿樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.1ppb

5.3.2 組織樣本處理方法一：

   稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ，加入6ml復(fù)溶液,，充分振蕩2min,，室溫4000r/min以上離心10min (若組織樣本中油脂含量較高，可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心),。取50µl上清液進(jìn)行分析,。

樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測下限：0.4ppb

5.3.3 組織樣本處理方法二：

1） 稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ，加入1ml復(fù)溶液,，振蕩混勻后加入4ml乙腈,，振蕩混勻后加入1ml異丙醇,，充分振蕩5min，室溫4000r/min以上離心10min,；

2） 取上清液3ml,，加入50ul 1M NaOH，加入7ml乙酸乙酯,，充分振蕩5min,，室溫4000r/min以上離心10min，取全部上清在56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥,；

3） 加入1ml 復(fù)溶液溶解干燥的殘留物,，加入1ml正己烷混合30s ；15℃ 4000轉(zhuǎn)/分 以上離心5min,。

4） 取50µl下層液進(jìn)行分析,。

組織樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.1ppb

5.3.4 飼料樣本處理方法：

1）稱取均質(zhì)后的飼料樣品1.0±0.05g，加入10ml甲醇,，再加入5g無水硫酸鈉,，振蕩2min；室溫 4000r/min以上離心10min,；

2）吸出離心后的上清液1ml,，于56℃氮氣吹干，用1 ml復(fù)溶液溶解干燥的殘留物,，再加入1mL正己烷混合30s,；室溫4000r/min以上離心5min。

3）取50µl下層進(jìn)行分析,。

    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：1ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻,。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃,。

實驗開始前,，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液,。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置,。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液,，用蓋板膜封板,，輕輕振蕩5秒混勻,，25℃反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜,，將孔內(nèi)液體甩干,，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒,，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl,，輕輕振蕩5秒混勻,，25℃避光顯色15分鐘。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl,，輕輕振蕩混勻,，終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）,。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成,。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%,，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖,。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度,。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算,，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析,。（索?。?/span>

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作,。

8.3 混合要均勻,，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的一致性,。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板,，避免光線照射,。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒,，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應(yīng)當(dāng)棄之,。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì),。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存,，避免冷凍,。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒,。