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熒光顯微鏡的原理及應(yīng)用
（一）熒光顯微鏡的原理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn) ：
熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過(guò)濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長(zhǎng)的光（如紫外光3650入或紫藍(lán)光4200入）作為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后,，再通過(guò)物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀察。這樣在強(qiáng)烈的對(duì)襯背景下,，即使熒光很微弱也易辨認(rèn),，敏感性高，主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學(xué)成分等的研究,。熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件（如熒光光源 ,、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等）的基礎(chǔ)上組成的,。熒光光源——般采用超高壓汞燈（50一200W）,，它可發(fā)出各種波長(zhǎng)的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn)生zui強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長(zhǎng) ,，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外,、紫色、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片）,，僅使一定波長(zhǎng)的激發(fā)光透過(guò)照射到標(biāo)本上,，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后,，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較照射波長(zhǎng)更長(zhǎng)的可見(jiàn)熒光,。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱,，為能觀察到專一的熒光,，在物鏡后面需加阻斷（或壓制）濾光片。它的作用有二： 一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡,、以免于擾熒光和損傷眼睛,，二是選擇并讓特異的熒光透過(guò)，表現(xiàn)出專一的熒光色彩,。兩種濾光片必須選擇配合使用。
（二）熒光顯微鏡就其光路來(lái)分有兩種：
1．透射式熒光顯微鏡: 激發(fā)光源是通過(guò)聚光鏡穿過(guò)標(biāo)本材料來(lái)激發(fā)熒光的,。常用暗視野集光器,，也可用普通集光器，調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上．這是比較舊式的熒光顯微鏡,。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng),，而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱．所以對(duì)觀察較大的標(biāo)本材料較好,。
2．落射式熒光顯微鏡這是近代發(fā)展起來(lái)的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面,，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡,。光路中需加上一個(gè)雙色束分離器，它與光鈾呈45,。角,，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上,，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面,、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，反回到雙色束分離器,，使激發(fā)光和熒光分開(kāi),，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊,，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要,。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰,，放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng),。
（三）熒光顯微鏡使用注意事項(xiàng)：
1、 嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出場(chǎng)說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作,，不要隨便改變程序,。
2、 在暗室中進(jìn)行檢驗(yàn),。進(jìn)入暗室后,，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5~15min,，待光源發(fā)出強(qiáng)光并穩(wěn)定后,，眼睛*適應(yīng)暗室，再開(kāi)始觀察標(biāo)本,。
3,、 防止紫外線對(duì)眼睛的傷害，再調(diào)整光源時(shí),，應(yīng)帶上防護(hù)眼睛,。
4、 檢查時(shí)間以一次1-2hrs為宜,，如果超過(guò)90min,，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱,；標(biāo)本受紫外線照射3~5min后,，標(biāo)本熒光也明顯減弱,；所以zui多不要超過(guò)2~3hrs。
5,、 熒光光源壽命有限,，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間,，保護(hù)光源,。天熱時(shí)，應(yīng)打開(kāi)電扇或空調(diào)散熱降溫,。換新燈泡應(yīng)從開(kāi)始使用就記錄時(shí)間,。等熄滅后欲在使用，待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃,。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源,。
6、 標(biāo)本染色后立即觀察,，時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱,。若將標(biāo)本保存在聚乙烯塑料袋中4度保存，可延緩熒光減弱時(shí)間,。
7,、 熒光強(qiáng)度的判斷標(biāo)準(zhǔn)；一般分為四級(jí),，1： 無(wú)或可見(jiàn)微弱熒光,，2：僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)熒光，3：可見(jiàn)有明亮的熒光,，4：可見(jiàn)耀眼的熒光,。