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關(guān)于層析柱裝柱,、使用及相關(guān)注意事項
閱讀：12491發(fā)布時間：2011-6-6
關(guān)于層析柱裝柱,、使用及相關(guān)注意事項
（1）,、裝柱前要仔細(xì)看填料的使用說明書，每種填料都有自己的特性,，以及特殊的裝柱方法,，針對不同的空柱，也要注意方法可能不同,；
3,、這一點(diǎn)非常重要：裝柱包括以后使用中不允許柱內(nèi)進(jìn)入氣泡（bubble free），柱頭事先也要排除氣泡,。
（2）,、填料要加水?dāng)嚢璩删鶆驊乙海瑧乙簼舛纫捞盍隙煌?，一?0－85%,，迅速倒入空柱內(nèi)，或吸或壓,，流速和具體步驟看說明書,。
（3）、所有柱子盡量做到填料均勻,，尤其是用于凝膠層析的柱子,。裝柱完成后，可用柱效測定的方法檢查裝填效果,。一個裝填合格的柱子的理論塔板高度應(yīng)是填料平均粒徑的2－4 倍,，在此范圍內(nèi)越小越好。
（4）,、選擇合適的泵,，**是流速滿足要求，脈沖盡量小,。柱塞泵,。
（5）、準(zhǔn)備上柱的液體應(yīng)進(jìn)行過濾,，至少是0.45micrometre,。
（6）、關(guān)于純化，**要考慮的是你的目標(biāo)：純度,、數(shù)量,、速度、收率等等,，再根據(jù)樣品的具體情況,，尤其是目標(biāo)蛋白的性質(zhì)，確定純化策略,。通常三步曲：capture,、purification、polishing,。*步先從大量或復(fù)雜樣品中將目標(biāo)蛋白%26ldquo;抓出%26rdquo;,，與主要雜質(zhì)分離；再用高選擇性的層析去除絕大部分雜質(zhì),；后精細(xì)純化,，提供純度至設(shè)定目標(biāo)。到實(shí)際工作中,，不要死靠三步,，也許一步也許四步或更多，具體情況具體分析,。所謂%26ldquo;三步%26rdquo;只是一種思路而已。
（7）,、至于測序,，我想大概不到1mg 應(yīng)該足夠了。
常壓反相硅膠柱的使用注意事項
C18反相硅膠的預(yù)處理很簡單,，就是用甲醇浸泡即可,。上海五相儀器對其使用作如下說明：使用的時候，將C18反相硅膠用甲醇混勻,，攪拌,，可以稍微超聲脫氣泡但不可時間太長，5分鐘吧,。然后勻漿裝柱,，用甲醇沖洗柱子2-3個柱體積，將C18中的交聯(lián)劑之類洗掉,，然后用你的洗脫劑沖洗主子2-3個柱體積,。洗脫劑的選擇可以根據(jù)液相也可以根據(jù)反相板。如果根據(jù)液相的話,，需要將液相條件中的有機(jī)相減小10%作為洗脫劑為好,。然后將你的帶分離物質(zhì)用洗脫劑溶解，上樣，加洗脫劑沖就可以了,。反相硅膠可以反復(fù)使用,，使用次數(shù)增多以后，有可能在柱子頂端產(chǎn)生顏色很深的色帶,，可以選擇用丙酮沖洗,，如果洗不掉可以選擇將其挖去，然后將主子內(nèi)C18硅膠保存在甲醇中即可,。注意不要甲醇干了,。
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