凱氏定氮儀的原理

凱氏定氮儀原理：蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物,。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解,，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨,。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù),，即為蛋白質(zhì)含量,。
　　

　　1.有機(jī)物中的胺根在強(qiáng)熱和CuSO4，濃H2SO4作用下,，硝化生成（NH4）2SO4
　　
　　反應(yīng)式為：
　　
　　2NH2+H2S04+2H＝（NH4）2S04（其中CuSO4做催化劑）
　　
　　2.在凱氏定氮器中與堿作用,，通過蒸餾釋放出NH3，收集于H3BO3溶液中
　　
　　反應(yīng)式為:
　　
　　（NH4）2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4
　　
　　2NH3+4H3BO3＝（NH4）2B4O7+5H2O
　　
　　3.用已知濃度的H2SO4（或HCI）標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,，根據(jù)HCI消耗的量計(jì)算出氮的含量,，然后乘以相應(yīng)的換算因子，既得蛋白質(zhì)的含量點(diǎn)焊機(jī)
　　
　　反應(yīng)式為：
　　
　　（NH4）2B4O7+H2SO4+5H2O＝（NH4）2SO4+4H3BO3（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3凱氏定氮儀操作步驟：（一）消化1,、準(zhǔn)備6個凱氏燒瓶,，標(biāo)號。1,、2,、3號燒瓶中分別加入適當(dāng)濃度的蛋白溶液1.0mL，樣品要加到燒瓶底部,，切勿沾在瓶口及瓶頸上,。再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g，濃硫酸2.0mL,，30%過氧化氫1.0mL,。4、5,、6號燒瓶作為空白對照,，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)，對樣品測定進(jìn)行校正,。4,、5、6號燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替樣液,，其余所加試劑與1,、2、3號燒瓶相同,。2,、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上,，接好抽氣裝置,。先用微火加熱煮沸，此時燒瓶內(nèi)物質(zhì)炭化變黑,，并產(chǎn)生大量泡沫,，務(wù)必注意防止氣泡沖出管口。待泡沫消失停止產(chǎn)生后，加大火力,，保持瓶內(nèi)液體微沸,，至溶液澄清后，再繼續(xù)加熱使消化液微沸15min,。在消化過程中要隨時轉(zhuǎn)動燒瓶,，以使內(nèi)壁粘著物質(zhì)均能流入底部，以保證樣品*消化,。消化時放出的氣體內(nèi)含SO2,，具有強(qiáng)烈刺激性，因此自始自終應(yīng)打開抽水泵將氣體抽入自來水排出,。整個消化過程均應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行,。消化*后，關(guān)閉火焰,，使燒瓶冷卻至室溫,。（二）蒸餾和吸收蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內(nèi)進(jìn)行的。凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多,，大體上都由蒸氣發(fā)生,、氨的蒸餾和氨的吸收三部分組成。1,、儀器的洗滌儀器安裝前,，各部件需經(jīng)一般方法洗滌干凈，所用橡皮管,、塞須浸在10%NaOH溶液中,，煮約10min，水洗,、水煮10min,，再水洗數(shù)次，然后安裝并固定在一只鐵架臺上,。儀器使用前,，微量全部管道都須經(jīng)水蒸氣洗滌，以除去管道內(nèi)可能殘留的氨,，正在使用的儀器,，每次測樣前，蒸氣洗滌5min即可,。較長時間未使用的儀器,，重復(fù)蒸氣洗滌，不得少于三次,，并檢查儀器是否正常,。仔細(xì)檢查各個連接處,，保證不漏氣。首先在蒸氣發(fā)生器中加約2/3體積蒸餾水,，加入數(shù)滴硫酸使其保持酸性,，以避免水中的氨被蒸出而影響結(jié)果，并放入少許沸石（或毛細(xì)管等）,，以防爆沸,。沿小玻杯壁加入蒸餾水約20mL讓水經(jīng)插管流入反應(yīng)室，但玻杯內(nèi)的水不要放光,，塞上棒狀玻塞,，保持水封，防止漏氣,。蒸氣發(fā)生后,，立即關(guān)閉廢液排放管上的開關(guān)，使蒸氣只能進(jìn)入反應(yīng)室,，導(dǎo)致反應(yīng)室內(nèi)的水迅速沸騰,，蒸出蒸氣由反應(yīng)室上端口通過定氮球進(jìn)入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置一個錐形瓶接收冷凝水,。從定氮球發(fā)燙開始計(jì)時,，連續(xù)蒸煮5min，然后移開煤氣燈,。沖洗完畢,，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接橡膠管，由于氣體冷卻壓力降低,，反應(yīng)室內(nèi)廢液自動抽到反應(yīng)室外殼中,，打開廢液排出口夾子放出廢液。如此清洗2～3次,，再在冷凝管下?lián)Q放一個盛有硼酸-指示劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口*浸沒在溶液中,，蒸餾1～2min，觀察錐形瓶內(nèi)的溶液是否變色,。如不變色,，表示蒸餾裝置內(nèi)部已洗干凈。移去錐形瓶,，再蒸餾1～2min,，用蒸餾水沖洗冷凝器下口，關(guān)閉煤氣燈,，儀器即可供測樣品使用,。2、無機(jī)氮標(biāo)準(zhǔn)樣品的蒸餾吸收由于定氮操作繁瑣,，為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術(shù),，初學(xué)者宜先用無機(jī)氮標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行反復(fù)練習(xí)，再進(jìn)行有機(jī)氮未知樣品的測定,。常用巳知濃度的標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨測試三次,。取潔凈的100mL錐形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL,，次甲基藍(lán)-甲基紅混合指示劑（呈紫紅色）3～4滴,，蓋好瓶口待用。取其中一只錐形瓶承接在冷凝管下端,，并使冷凝管的出口浸沒在溶液中,。注意：在此操作之前必須先打開收集器活塞，以免錐形瓶內(nèi)液體倒吸,。準(zhǔn)確吸取2mL硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液加到玻杯中,，小心提起棒狀玻塞使硫酸銨溶液慢慢流入蒸餾瓶中，用少量蒸餾水沖洗小玻杯3次,，一并放人蒸餾瓶中,。然后用量筒向小玻杯中加入10mL30%NaOH溶液，使堿液慢慢流入蒸餾瓶中,，在堿液尚未*流入時,，將棒狀玻塞蓋緊。向小玻杯中加約5mL蒸餾水,，再慢慢打開玻塞,，使一半水流入蒸餾瓶，一半留在小玻杯中作水封,。關(guān)閉收集器活塞,，加熱蒸氣發(fā)生器，進(jìn)行蒸餾,。錐形瓶中的硼酸-指示劑混合液由于吸收了氨,，由紫紅色變成綠色。自變色時起,，再蒸餾3～5min,，移動錐形瓶使瓶內(nèi)液面離開冷凝管下口約lcm，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管下口,，再繼續(xù)蒸餾1min,，移開錐形瓶，蓋好,，準(zhǔn)備滴定,。在一次蒸餾完畢后，移去煤氣燈,，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器間的橡膠管,，排除反應(yīng)完畢的廢液,，用水沖洗小玻杯幾次，并將廢液排除,。如此反復(fù)沖洗干凈后,，即可進(jìn)行下一個樣品的蒸餾。按以上方法用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨再做兩次,。另取2mL蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨進(jìn)行空白測定二次,。將各次蒸餾的錐形瓶一起滴定。3,、未知樣品及空白的蒸餾吸收將消化好的蛋白樣品三支,，空白對照液三支，依次作蒸餾吸收,。加5mL熱的蒸餾水至消化好的樣品或空白對照液中,，通過小玻杯加到反應(yīng)室中，再用熱蒸餾水洗滌小玻杯3次,，每次用水量約3mL,，洗滌液一并倒入反應(yīng)室內(nèi)。其余操作按標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨的蒸餾進(jìn)行,。由于消化液內(nèi)硫酸鉀濃度高而呈粘稠狀,，不易從凱氏燒瓶內(nèi)倒出，必須加入熱蒸餾水5mL稀釋之,，如果有結(jié)晶析出,，必須微熱溶解，趁熱加入玻杯,，使其流入反應(yīng)室,。此外，還應(yīng)當(dāng)注意趁儀器洗滌尚未*冷卻時立即加入樣品或空白對照液,，否則消化液通過冷卻的管道容易析出結(jié)晶,，造成堵塞。（三）凱氏定氮儀滴定樣品和空白蒸餾完畢后,，一起進(jìn)行滴定,。打開接受瓶蓋，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行滴定,。待滴至瓶內(nèi)溶液呈暗灰色時,，用蒸餾水將錐形瓶內(nèi)壁四周淋洗一次。若振搖后復(fù)現(xiàn)綠色,，應(yīng)再小心滴入標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液半滴,，振搖觀察瓶內(nèi)溶液顏色變化，暗灰色在一二分鐘內(nèi)不變,，當(dāng)視為到達(dá)滴定終點(diǎn),。若呈粉紅色,，表明已超越滴定終點(diǎn)，可在已滴定耗用的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液用量中減去0.02mL,，每組樣品的定氮終點(diǎn)顏色必須*一致,。空白對照液接受瓶內(nèi)的溶液顏色不變或略有變化尚未出現(xiàn)綠色,，可以不滴定。記錄每次滴定耗用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液毫升數(shù),，供計(jì)算用,。

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