化工儀器網(wǎng)
產(chǎn)品簡介
公司主營產(chǎn)品：ELISA試劑盒,，Omega試劑盒,，放免試劑盒，ATCC細(xì)胞,，血清,，抗體，生物科研試劑等系列產(chǎn)品,，現(xiàn)貨供應(yīng),，物美價(jià)廉,。歡迎客戶“人WARS ELISA試劑盒"詳細(xì)說明書,。
詳細(xì)介紹
檢測試劑盒 elisa實(shí)驗(yàn) WARS
產(chǎn)品名稱：人WARS ELISA試劑盒
產(chǎn)品別名：人色氨酰tRNA合成酶ELISA試劑盒
英文名稱：Human tryptophanyl-tRNA synthetase,WARS ELISA KIT
產(chǎn)品規(guī)格：48T/96T
檢測方法：ELISA酶聯(lián)免疫
待檢樣本：體液，血清,，血漿,，細(xì)胞培養(yǎng)上清液，尿液,，組織勻漿,心房水標(biāo)本等等,。
保存條件：2-8℃
ELISA技術(shù)操作要點(diǎn)
ELISA技術(shù)操作要點(diǎn)，ELISA的主要試劑為固相的抗原或抗體,、酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應(yīng)底物,。以下敘述這些試劑的原料和制備方法。
（一）ELISA技術(shù)操作要點(diǎn)，固相載體
可作ELISA中載體的物質(zhì)很多,，zui常用的是聚苯乙烯,。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性,。聚苯乙烯為塑料,，可制成各種形式。在ELISA測定過程中,，它作為載體和容器,，不參與化學(xué)反應(yīng)。加之它的價(jià)格低廉,，所以被普遍采用,。
ELISA載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應(yīng)板,。小試管的特點(diǎn)是還能兼作反應(yīng)的容器,，zui后放入分光光度計(jì)中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球,，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加,。如用特殊的洗滌器，在洗滌過程中使圓珠滾動(dòng)淋洗,，效果更好,。zui常用的載體為微量反應(yīng)板，于ELISA測定的產(chǎn)品也稱為ELISA板,，通用的標(biāo)準(zhǔn)板形是8×12的96孔式,。為便于作少量標(biāo)本的檢測，有制成8聯(lián)或12聯(lián)孔條的,，放入座架后,，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測,，并可在特定的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果?，F(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量反應(yīng)板型的ELISA檢測，包括加樣,、洗滌,、保溫、比色等步驟,，對操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利,。
良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低,，孔底透明度高,，各板之間和同一板各孔之間性能相近,。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,。因此每一批號的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能,。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗人IgG抗體,，保溫后洗滌,，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測每孔溶液的吸光度,?？刂品磻?yīng)條件，使各讀數(shù)在0.8左右,。計(jì)算所有讀數(shù)的平均值,。所有單個(gè)讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于10％。
與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯,。作為ELISA固相載體,，聚氯乙烯板的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可切割,，價(jià)廉,、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高,，但空白值有時(shí)也略高,。
為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗(yàn)：用其它免疫學(xué)測定方法選出一個(gè)典型的陽性標(biāo)本和一個(gè)典型的陰性標(biāo)本,。將它們分別進(jìn)行一系列稀釋后,，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測定，然后比較測定結(jié)果,。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果判別zui大,，這種載體就是這一ELISA測定的zui合適的固相載體。
除塑料制品外,，固相酶免疫測定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜,，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等,，這類測定形式將在本章第五節(jié)“膜載體的酶免疫測定”中介紹,。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的,，反應(yīng)時(shí)固相微粒懸浮在溶液中,，具有液相反應(yīng)的速率，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸引作為分離的手段,，洗滌也十分方便,，但需配備特殊的儀器,。
（二）ELISA技術(shù)操作要點(diǎn)，抗原和抗體
在ELISA實(shí)施過程中,，抗原和抗體的質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵因素,。本法要求所用抗原純度高，抗體效價(jià)高,、親和力強(qiáng),。
ELISA所用抗原有三個(gè)來源：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原,。天然抗原取材于動(dòng)物組織或體液,、微生物培養(yǎng)物等，一般含有多種抗原成分,，需經(jīng)純化,，提取出特定的抗原成分后才可應(yīng)用，因此也稱提純抗原（purifiedantigen）,。重組抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均為人工合成品,，使用安全，而且純度高,，干擾物質(zhì)少,。因此雖然制備合成抗原有較高的技術(shù)難度且要求較為昂貴的儀器設(shè)備和試劑，其應(yīng)用仍十分普遍,，特別是對那些天然抗原不易得到的試驗(yàn),，更顯出其獨(dú)到之處。
用于ELISA的抗體有多克隆的和單克隆的,?？寡宄煞謴?fù)雜，應(yīng)從中提取IgG才可用于包被固相或酶標(biāo)記,。含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高,，有時(shí)可適當(dāng)稀釋后直接進(jìn)行包被。制備酶結(jié)合物用的抗體的質(zhì)量往往要求有較高的純度,。經(jīng)硫酸銨鹽析純化的IgG可進(jìn)一步用各種分子篩層析提純,。也可用親和層析法提純特異性IgG，如用酶消化IgG后提取的Fab片段,，則效果更好,。
（三）ELISA技術(shù)操作要點(diǎn)，免疫吸附劑
固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑,。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被（coating）,。由于載體的不同，包被的方法也不同,。如以聚苯乙烯ELISA板為載體,，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（zui常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中,，加于ELISA板孔中在4℃過夜，經(jīng)清洗后即可應(yīng)用,。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低,，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)*覆蓋，其后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會(huì)部分地吸附于固相載體表面,，zui后產(chǎn)生非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高,。在這種情況下，如在包被后再用1％～5％牛血清白蛋白包被一次,，可以消除這種干擾,。這一過程稱為封閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時(shí)間而不失去其免疫活性,。
（四）ELISA技術(shù)操作要點(diǎn),，酶和底物
ELISA中所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高,、專一性強(qiáng),、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富,、價(jià)格不貴,、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力,。在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶,。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價(jià)格低廉,，有色產(chǎn)物易于測定,，光吸收高。ELISA中zui常用的酶為辣根過氧化酶（HRP）和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶（AP）,。
HRP在蔬菜作物辣根中含量很高,，純化方法也不復(fù)雜。它是一種糖蛋白,，含糖量約18％,；分子量為44kD；是一種復(fù)合酶,，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì),。主酶為無色糖蛋白，在275nm波長處有zui高吸收峰,；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán),，在403nm波長處有zui高吸收峰。
（五）ELISA技術(shù)操作要點(diǎn),，結(jié)合物
酶標(biāo)記的抗原或抗體稱為結(jié)合物（conjugate）,。抗原由于化學(xué)結(jié)構(gòu)不同,，可用不同的方法與酶結(jié)合,。如為蛋白質(zhì)抗原，基本上可參考抗體酶標(biāo)記的方法,。制備抗體酶結(jié)合物的方法通常有以下幾種,。
1．戊二醛交聯(lián)法戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可以使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過它而偶聯(lián),。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如連接AP）,，也可用二步法（如連接HRP）。舉例如下：
2～5mg純抗體與5mgAP混合于0.1mol/LpH6.8的磷酸緩沖液1ml中,，4℃下對同上緩沖液透析平衡,。磁力攪拌下，緩慢加入1％戊二醛0.05ml,，在室溫下放置2小時(shí),。在4℃下對0.05mol/LpH8.0Tris緩沖液透析平衡，即得酶標(biāo)抗體,。
辣根過氧化物酶可溶解于50％飽和度硫酸銨中,。用上法交聯(lián)后可用50％飽和度硫酸銨沉淀酶標(biāo)抗體，棄去上清中游離酶,。
戊二醛一步法操作簡便,、有效，而且重復(fù)性好,。缺點(diǎn)是交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格,，大小也不一，影響效果,。
制備HRP抗體結(jié)合物也可用二步法,，即先將HRP與戊二醛作用，透析除去戊二醛,，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體,。此法的效率可高于一步法10倍左右。
2．過碘酸鹽氧化法本法只用于HRP的交聯(lián),。該酶含18％碳水化合物,，過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼氫化鈉（NaBH4）中和多余的過碘酸,。酶上的醛根很活潑,，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成按摩爾比例結(jié)合的酶標(biāo)結(jié)合物,。有人認(rèn)為此法為辣根過氧化物酶交聯(lián)zui有效的方法,。但也有只認(rèn)為由于所用試劑較為劇烈,，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重復(fù)。
檢測試劑盒 elisa實(shí)驗(yàn) WARS