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恒遠(yuǎn)生物為您分析：脯氨酸含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法
閱讀：1192 發(fā)布時(shí)間：2014-2-20在逆境條件下（旱,、鹽堿,、熱、冷,、凍）,，植物體內(nèi)脯氨酸（proline，Pro）的含量顯著增加,。植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。因此測(cè)定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標(biāo),。
脯氨酸測(cè)定原理：
用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí),，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后,，溶液即成紅色,，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中,，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低,。在520nm波長下比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出（或用回歸方程計(jì)算）脯氨酸的含量,。
試劑：1. 酸性茚三酮溶液：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中,，攪拌加熱（70℃）溶解，貯于冰箱中,；
2. 3％磺基水楊酸：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml,；
3. 冰醋酸；
4. 甲苯,。
5. 6mmol/L的磷酸：320.6ml磷酸（分析純）定容到1L,。
脯氨酸測(cè)定方法：
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
（1）在分析天平上稱取25mg脯氨酸,，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解,，然后倒入250ml容量瓶中,，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中每ml含脯氨酸100μg,。
（2）系列脯氨酸濃度的配制：取6個(gè)50ml容量瓶,，分別盛入脯氨酸原液0.5，1.0,，1.5,，2.0，2.5及3.0ml,，用蒸餾水定容至刻度,，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為1,，2,，3，4,，5及6 μg/ ml,。
（3）6支試管，分別吸取2ml系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液,，每管在沸水浴中加熱30min,。
（4）冷卻后各試管準(zhǔn)確加入4ml甲苯，振蕩30S,，靜置片刻,，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。
（5）用移液器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中,，以甲苯溶液為空白對(duì)照,，于520nm波長處進(jìn)行比色。
（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸濃度（X）而變的回歸方程式,，再按回歸方程式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，計(jì)算2ml測(cè)定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。
2. 樣品的測(cè)定
（1） 脯氨酸的提?。簻?zhǔn)確稱取不同處理的待測(cè)植物葉片各0.5g,，分別置大試管中，然后向各管分別加入5ml 3％的磺基水楊酸溶液,，在沸水浴中提取10min,，（提取過程中要經(jīng)常搖動(dòng)），冷卻后過濾于干凈的試管中,，濾液即為脯氨酸的提取液,。
（2） 吸取2ml提取液于另一干凈的帶玻塞試管中,，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min,，溶液即呈紅色,。
（3） 冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30S,，靜置片刻，取上層液至10ml離心管中,，在3000rpm下離心5min,。
（4） 用移液器輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對(duì)照,，在分光光度計(jì)520nm波長處比色,，求得吸光度值。